时间:2023-03-07 14:58:19
序论:好文章的创作是一个不断探索和完善的过程,我们为您推荐十篇检测鉴定报告范例,希望它们能助您一臂之力,提升您的阅读品质,带来更深刻的阅读感受。
在研究基因功能的过程中,不可避免地要研究基因的调控机制,而基因的表达产物复杂且难以对其定量和定性,要在细胞生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难。但报告基因分析系统的发现给基因调控与表达的研究带来了新的希望。近年来,报告基因系统的研究取得了快速的发展。报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控,因此,对真核基因调控的了解可以不通过直接测定调控元件调节转录速率的能力,而是把顺式调控元件与报告基因的序列连接起来,在基因转录的过程中测定报告基因转录产物的表达量,从而判断相应的顺式作用元件的调控能力。作为报告基因必须具备以下特点:(1)由原核基因编码的基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物;(2)细胞内其他基因产物不会干扰报告基因产物的检测;(3)报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高、重复性好。该技术的主要优点是灵敏度高、可信性大及检测方便且适合大规模检测,目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件[13]。荧光素酶(LUC)报告基因来源于北美萤火虫,能催化萤火虫的氧化性羧化作用,同时发射出光子,可被光度计捕获定量。LUC的分析具有快速、方便、线性较好等优点,正成为最广泛使用的报告基因。pGL3系列的质粒就是带有LUC报告基因的质粒载体,我们可以利用这一系列的工具载体研究果蝇中基因的表达调控方式,其中pGL3Control带有SV40的启动子和增强子。SV40是一种猴病毒, 它的增强子/启动子区域可使其在大多数细胞株中有高度的组成性表达,因而广泛用于构建真核基因的表达载体,因此pGL3Control可作为检测体系中的阳性对照。但由于SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达,所以我们将果蝇actin 5C 蛋白的启动子(pac)[4]构建到质粒pGL3Basic中,得到了高表达LUC的重组载体pGL3pac。这一质粒的构建可为研究果蝇中基因的调控方式奠定基础,同时也可为研究其他报告基因在不同细胞中的表达提供借鉴作用。
1 材料和方法
1.1 菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α(作者所在实验室保存),质粒pGL3Basic(Promega公司),pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen公司),限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ及T4连接酶、DNA聚合酶(TaKaRa公司),小量胶回收试剂盒(TaKaRa公司),中量质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司),LUC检测试剂盒(Promega公司),S2细胞Schneider培养基(Invitrogen公司),胎牛血清(Gibco公司)。
12 方法
1.2.1 pac启动子的获得 以pAc5.1/V5His/LacZ质粒为模板进行PCR扩增。上游引物5′GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3′,下游引物5′GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3′(划线部分分别为XhoⅠ和HindⅢ酶切位点)。PCR反应参数为:95 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,共30个循环; 72 ℃延伸10 min。
1.2.2 重组质粒的构建鉴定与中量抽提纯化 PCR产物分别经XhoⅠ、HindⅢ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,割胶回收酶切片段,与同样经酶切、割胶回收的pGL3Basic质粒于16 ℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5α,并涂布于含氨苄青霉素(终质量浓度为50 mg・L-1)的固体培养基上,37 ℃过夜培养。挑阳性克隆提取质粒,酶切和测序鉴定,鉴定正确的质粒经中量质粒抽提试剂盒提取纯化。
1.2.3 S2细胞培养及瞬时转染 S2细胞由本实验室冻存,使用Schneider培养基,补以10%胎牛血清。S2细胞培养在28 ℃无CO2培养箱中,根据其生长状态,按一定比例每3 d传代1次。待细胞生长状态良好时进行瞬时转染分析。转染时在12孔板中接种1×106个细胞,加入1 ml含10%胎牛血清的Schneider培养基,置28 ℃无CO2培养箱中培养6~16 h[细胞生长至对数生长期达(2~4)×106ml-1],在1.5 ml Eppendorf 管中准备以下试剂:溶液A,12 μl 2 mol・L-1 CaCl2,5 μg重组质粒,1 μg pAcLacZ质粒,加入双蒸水至总体积为100 μl,混匀待用;溶液B,100 μl2×HBS。将A溶液缓慢加入B溶液中,轻轻混匀,室温放置30 min,以形成Ca3PO4DNA复合物。将Ca3PO4DNA复合物逐滴加至细胞上,混匀后置28 ℃无CO2培养箱中继续培养,24 h后用含10%胎牛血清的Schneider培养基给细胞换液。细胞转染48 h后裂解细胞,先吸去培养液,用PBS洗2遍,在每个培养孔中加入200 μl Reporter lysis buffer,保证充分覆盖细胞,冻融1次以确保细胞裂解,将细胞裂解液移至1.5 ml Eppendorf管中,振荡10~15 s,离心(12 000×g,2 min,4 ℃),转移上清于新管。制备好的细胞裂解液可用于测定或贮存于-70 ℃备用。
1.2.4 LUC和β半乳糖苷酶(βgal)活性测定 取制备好的细胞裂解液进行LUC和βgal活性的测定。LUC活性测定前取20 μl平衡至室温的细胞裂解液,加入80 μl LUC底物,迅速混匀,置光度计中,记录读数。βgal活性测定根据分子克隆的方法,在每个用于测定转染细胞裂解物的Eppendorf管中加入100×Mg2+ 3 μl、1×ONPG 66 μl、细胞裂解物30 μl、0.1 mol・L-1Na3PO4 201 μl,混匀。置37 ℃保温30 min,以500 μl 1 mol・L-1 Na2CO3终止显色反应。置酶标仪上,在波长420 nm处读光吸收值来表示βgal的活性,以共转化的βgal活性作为内源对照,以/βgal活性的值为系数,比较各组在转化效率相同时LUC活性的相互关系。以没有任何插入片段时pGL3Basic的LUC活性为1,比较加上插入片段pac启动子后的LUC活性增加的倍数,即LUC的相对活性,以反映LUC基因表达的相对水平。
2 结
果
2.1 重组载体的构建鉴定与纯化以pAc5.1/V5His/LacZ质粒为模板,通过上游引物和下游引物PCR扩增获得pac启动子2 500 bp基因片段(图1),用XhoⅠ、HindⅢ双酶切后克隆到载体pGL3Basic中(图2)。提取重组阳性质粒,XhoⅠ、HindⅢ双酶切后得到2 500 bp的基因片段(图1)。经测序鉴定,阅读框架不变。鉴定完成的重组质粒经过质粒中量抽提试剂盒提取纯化,得到符合转染所需的高纯度高浓度的重组质粒pGL3pac,经测定其260 nm的OD值,计算得到其浓度为0.99 μg・μl-1,A260 nm/A280 nm为1.81。
2.2 S2细胞的瞬时转染分析转染结果显示,pGL3Basic和pGL3Control中LUC的相对活性无明显差异,提示SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达或低表达。而pGL3pac中插入了pac启动子,LUC的相对活性明显增高。pGL3pac在果蝇S2细胞中LUC的活性是pGL3Basic LUC活性的近2.7万倍。见表1。表1 瞬时转染后各组分酶活性值
3 讨
论
LUC是现在常用的一种报告基因,因其无放射性、检测快、灵敏度高、半衰期短、线性好等特点而得到广泛的应用。我们构建了pGL3pac这一重组质粒,使得在果蝇S2细胞中能够高表达LUC,为进一步的实验提供了一个好的工具。首先,它可作为基因启动子分析研究中的阳性对照,通过与该重组质粒的转染结果比较,从而判定不同顺式作用元件对转录的影响。其次,我们可以将目的基因某一区域的启动子元件插入到重组质粒pGL3pac启动子的上游或下游,通过LUC表达量改变的放大作用,进一步分析这些启动子元件的生物学作用,找到在转录过程中起到关键作用的核心启动子序列。在此基础上,我们还可以了解特定的反式作用因子对基因表达的影响。再次,还可以将目的基因自身的5′端或3′端的UTR序列插入到LUC基因的上下游,通过检测LUC的水平,为翻译水平的调控提供依据。在实验过程中,有很多方面值得我们注意。第一,在重组质粒利用中量试剂盒抽提纯化时,想得到浓度高的产物,应注意在菌液的培养量和培养时间上进行调整。因实际环境的不同,按照操作说明所示的条件往往难以得到足够的质粒量,通过增加培养的菌液量和延长培养时间可取得很好的效果。由于所得的质粒是细胞转染所需,故在抽提纯化时应特别强调无菌的原则。第二,在转染实验中,重组质粒pGL3pac必须共同转染表达另外一带有报告基因的质粒以衡量转染效率。我们选择了pAcLacZ,该质粒含lacZ基因,能够表达βgal,利用βgal水解底物ONPG的能力计算出βgal的活性,以此作为内源对照衡量不同组分的转染效率。这个质粒与目的质粒的转染比例对于结果有很大的影响。因βgal的活性在0.2~0.8之间符合线性范围,所以可根据这一要求摸索合适的转染比例,通过实验可得出两者在5∶1浓度比时较合适。另外,还可以选择带有其它报告基因的质粒载体,如phRL是一种带有海肾荧光素酶(RLUC)报告基因的质粒载体,如果选择phRL作为共转质粒则可通过在一管细胞裂解液中先后加入不同的底物,用同种仪器测定酶的活性即可,因其测定的两种酶的活性在同一数量级而且减少实验步骤,使实验数据更加可靠,实验过程更加简便[5]。第三,我们是通过瞬时转染得出结论,为排除一些因素的影响,转染实验必须重复3或4次,本实验的转染数据即是3次实验的平均值。在实验中我们选择了pac替代pGL3Control中的SV40启动子,主要是因为果蝇actin 5C蛋白组在果蝇体内为组成性表达且不需诱导,因此,利用pac作为替换启动子,不仅能产生较好的效果而且可简化实验操作。这一质粒的构建不仅为我们在细胞水平利用报告基因系统研究果蝇中基因的表达调控方式提供工具载体,而且它的构建方法提示我们可通过相同的途径构建适合转染不同类型细胞的带有报告基因的质粒载体,作为相应研究的基础。
[参考文献]
[1]LOUISE H. Reporter gene technology:the future looks bright [J].Biochem Pharmacol,1999,58:749757.
[2]GAMBHIR S S,BARRIO J R,HERSCHMAN H R,et al. Assays for noninvasive imaging of reporter gene expression [J]. Nucl Med Biol,1999,26:481490.
【关键词】 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;全血
文章编号:1003-1383(2012)04-0530-02
中图分类号:R 555 文献标识码:A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2012.04.033
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehidrogenase,G6PD)缺乏症在全世界累及1亿人以上,我国发生率约为0.2%~15.7%,尤以南方各省较高[1]。为了解本县辖区内人群G6PD缺乏发生率,我们收集在我院门诊就诊和住院病人的血标本,进行G6PD活性定量检测,现将结果报告如下。
对象与方法
1.对象 2010年11月~2011年9月我院住院和门诊就诊患者的全血标本22 929例,其中男性12 694例,女性10 235例。有汉族、壮族和瑶族,汉族18 343例占80.0%,壮族3 898例占17.0%,瑶族688例占3.0%。年龄0~82岁,其中0~18岁7 960例,19~45岁4 302例,46~82岁10 667例,农村和城镇分别为14 904例和8 025例。
2.仪器和试剂 仪器:日本罗氏Modular P800模块,试剂:长春汇力生物技术有限公司提供的G6PD定量试剂盒。用EDTA.K2抗凝管抽取静脉血,新生儿可采用脐带血。
3.方法 标本按操作说明书处理,经溶血后用定量法上机检测,各步操作均严格按照试剂和仪器说明书进行,并执行每天室内质控。标本送检后于当天检测,不能当天检测的置2~8℃冰箱保存次日检测。正常参考值范围:成人638~1980 U/L,脐带血:832~2460 U/L。低于参考值下限为缺乏。
4.观察项目 分析比较不同性别、民族和年龄者的检测结果。
5.统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件处理数据。计数资料以百分率表示,组间比较用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.不同性别的检测结果比较 22 929例全血标本G6PD酶活性测定总缺乏率为8.02%,其中男性缺乏率为9.49%,女性缺乏率为6.19%,男性缺乏率显著高于女性(P<0.01)。见表1。
2.不同民族的检测结果比较 汉族缺乏率为7.68%,壮族为9.08%,瑶族为11.05%,三种民族的缺乏率比较差异有统计学意义(P<0.01),其中少数民族的缺乏率显著高于汉族
(P<0.01)。见表2。
3.不同年龄段的检测结果比较 0~18岁缺乏率为10.11%,19~45岁为6.58%,46~82岁为7.04%,不同年龄组的缺乏率比较差异有统计学意义(P<0.01),其中0~18岁年龄段的缺乏率最高(P<0.01)。见表3。
讨 论
G6PD缺乏症为伴性不完全显性遗传病,是世界上最常见的酶缺乏症,突变基因定位于X染色体上,男性为一条X和一条Y染色体,为半合子,酶活性显著降低,可以发病。其缺陷基因来自母亲,并传给女儿,她们均为杂合子,能产生足够量正常的G6PD酶,通常不出现任何症状。血中含G6PD酶活性正常和缺乏两类红细胞,两者之比例决定酶活性测定的结果,其变动幅度很大,多数为中间缺乏值,少数接近正常参考值,很少数与半合子相近而可发病。女性纯合子酶活性显著降低,只有当她们的儿子出现缺陷时,才可能发现其异常基因,但很少见。G6PD缺乏症的发病者绝大多数为男性[1],因此临床上男性缺乏率高于女性缺乏率。本组资料男性缺乏率为9.49%,女性缺乏率为6.19%,男性缺乏率显著高于女性(P<0.01),与上述理论相符,但性别缺乏率高于文献[2,3]报道,可能与不同地区、不同民族、不同年龄组,使用不同的检测方法有关。
不同民族间G6PD缺乏率,汉族为7.68%,壮族为9.08%,瑶族为11.05%,三种民族的缺乏率比较差异有统计学意义(P<0.01),其中少数民族的缺乏率显著高于汉族(P<0.01)。可能与当地少数民族的生活习俗,例如偏爱使用民间医疗偏方,以及各民族间的婚姻状况和优生优育重视程度不同有关。
不同年龄组G6PD缺乏率为0~18岁10.11%,19~45岁为6.58%,46~82岁为7.04%,不同年龄组的缺乏率比较差异有统计学意义(P<0.01),其中0~18岁的年龄段缺乏率最高(P<0.01)。可能与2003年国家取消强制婚检后,人们对婚检不够重视,婚检率明显下降,导致出生缺陷儿明显上升有关。46~82岁比19~45岁缺乏率稍高,但差异无统计学意义(P>0.05),可能与取消强制婚检前的医疗筛查水平较为稳定有关。
G6PD缺乏是一种红细胞酶缺陷症,引起溶血的主要原因是G6PD是一种可防止红细胞氧化的酶,如果G6PD不足,红细胞易受氧化损伤。当红细胞暴露于氧化剂,其细胞结构将改变,引起细胞内的血红蛋白沉淀(海因兹小体),造成红细胞破裂[4],即溶血。常见溶血类型有先天性非球形红细胞性溶血性贫血、蚕豆病、药物诱发溶血、感染诱发溶血和新生儿高胆红素血症。目前筛查方法主要有高铁血红蛋白还原试验、硝基四氮唑蓝试验、Heinz小体、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定、分子生物学法等,前四种方法为筛选试验,后两种方法为确诊试验[5]。本文采用全自动生化仪检测G6PD,能准确反映酶活性。G6PD缺乏患者,酶活性一般都降低,根据缺乏程度,缺乏程度越高,酶活性检测值越低。G6PD缺乏症目前尚无根治方法,一旦发病,只能对症治疗。
综上所述,G6PD缺乏症在本地区有较高的发病率,并且存在性别、民族和年龄上的差异,重视对住院病人和门诊就诊者的G6PD检测,对指导用药对症治疗、优生优育,提高人口素质等均具有重要的意义。
参考文献
[1]陶元鋆.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症[M]//血液学及血液学检验.北京:人民卫生出版社,1997:116-118.
[2]黄作群,唐 萍,覃桂芳,等.1 720例新生儿脐血G6PD筛查报告[J].广西医学,2007,29(8):1185-1186.
[3]姚英资,谭智伟,杨 孜,等. 深圳市龙岗区3 465例育龄人群G6PD缺乏症筛查分析[J].吉林医学,2011,32(13):2616-1617.
第一点:学会妥协。
妥协是最高的艺术,在合作的过程中,不免会有一些冲突,这时就需要我们冷静下来想想问题的解决方法,每个人都做一些退让,那么事情就容易解决了。
第二点:团队精神,同甘共苦。
这是一个老生常谈的词,但在这种实践中不得不提及,因为它无处不在,记得很清楚的是很多次我们在测量场地上吃午饭的;是我们都很早起床,然后在冷风飕飕中作业,每个人都在打颤;是我们都扛着仪器摸着黑回家。这一切的苦与乐,我们都一起承担。同甘共苦,我们很快乐!
第三点:感染力很重要。
在一个团队中,要想有好的氛围,第一个提意见的人的思想是很重要的,因为后来的人都不免会有从众心理。如果他(她)的想法是积极的,那么会有人也会积极的想一些问题。反之,则整个团队就陷入消极的氛围中。所以,我们每个人都应该积极的想问题。
第四点:多多思考。
实习是什么,实习是将理论知识内化为自己知识的过程。实习过程中只有多多思考,才能多多消化知识,还能延伸出很多以前不知道的。
做最“卑微”的工作,树高傲的自尊。一个好的团队,需要每个人都勤奋一点,不怕脏、不怕累,而不是推三落四。只有每个人都积极的做每件事,才能达到实习的目的,使每个人都熟悉每一个环节。
长大了,要试着去承担一些责任。我们生来就有一种惰性,无论是个人,还是一个团队,如果是在一个惰性的氛围中,那她(们)的效率一定不会很高,但如果每个人都有强烈的责任感,能够努力去承担一些责任,那么效率不仅提高了,而且任务也会完成的很好。
【Abstract】Objective:Comprehensive to analyze the sources and influencing factors of content uncertainty of Vitamin A in health food by HPLC.Methods:According to the testing process,a mathematical model was established to analyze the sources and influencing factors in uncertainty,through the quantitative analysis of uncertainty,obtained the expanded uncertainty.Result:The expanded uncertainty of Vitamin A in health food by HPLC was 1.843%.Conclusion:The main sources of uncertainty of Vitamin A in health food by HPLC was regulating the concentration of standard solution,preparation of standard solution and the repeatability of method.
【Keywords】HPLC;Vitamin A;Mathematical model;Uncertainty
引言
维生素A能够调节人体的多种生理机能,增强机体免疫能力,在调节体内各方面的代谢及促进骨骼的生长发育上有着极其重要的作用,同时它也参与视网膜视紫质的合成与再生,维持正常的视觉反应,以降低夜盲症和视力减退的发生[1,2]。而维生素A摄入过量也会引起副作用,可损害脑组织等,因此维生素A制剂含量的控制十分重要[3]。本文根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[4],并参考JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》[5],结合检测方法和数学模型,对高效液相色谱法测定保健食品中维生素A的含量进行不确定度评估,找出不确定度主要来源,为方法的优化和评定测量结果提供依据。
研究部分
1.提要
1.1测量方法:GB/T 5009.82-2003。
1.2基本原理:试样经过高温皂化、提取处理后,用乙醚萃取,蒸干乙醚后用乙醇定量溶解。利用高效液相色谱仪对样品中的维生素A进行分离和测定。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1仪器设备:
Agilent-1260高效液相色谱仪; KQ-500VED型超声仪;
EMS-50型恒温水浴锅; UV-2450紫外分光光度计;
R-202旋转蒸发仪; XP-205分析天平;
MS-304S分析天平。
2.1.2试药:
乙醇(AR);抗坏血酸(AR);氢氧化钾(AR);乙醚(AR);无水硫酸钠(AR);甲醇(色谱纯)。
芘(厂家:DR,批号:01116,纯度:99.0%);维生素A(厂家:SIGMA,批号:BCBG2044V,纯度:98.0%)。
2.2色谱条件:
色谱柱:CNW Athena C18-WP(5μm,150mm×4.6mm);流动相:甲醇:水=(94:6);
流速:1.0mL/min;柱温:40℃;检测波长:300nm。
2.3分析步骤:
2.3.1内标溶液的配制
精密称取芘内标物49.28mg至1000ml容量瓶中,用乙醇溶解并定容至刻度,摇匀,作为内标溶液。
2.3.2标准储备母液的配制
精密称取维生素A对照品12.35mg至100ml容量瓶,用乙醇溶解并定容至刻度,摇匀,作为标准储备母液。
2.3.3标准溶液的配制
精密量取标准储备母液0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,5.0mL,置于25mL棕色容量瓶中,精密加入内标溶液3mL,用乙醇稀释至刻度,摇匀,即得5个不同浓度的标准溶液。
2.3.4标准溶液的浓度校正
精密量取1mL标准储备母液至50mL容量瓶中,加入适量乙醇摇匀并定容至刻度,以乙醇为空白,在325nm波长处测定,其平均吸光度为0.4376。维生素A的吸光系数为1835。
2.3.5样品处理
2.3.5.1皂化
本实验样品为维生素A维生素D软胶囊(儿童型)。取20粒样品,挤出内容物,搅拌均匀。精密称取试样0.1g,置于250mL锥形瓶中,用约50mL乙醇使其溶解,直到颗粒物分散均匀为止。加入25mL 10%抗坏血酸水溶液、3mL内标溶液、10mL氢氧化钾水溶液(1:1),混匀。于沸水浴回流60min,使皂化完全。取出立刻冷却至室温。
2.3.5.2 提取及浓缩
用50mL的水分两次将皂化液全部转入500 mL分液漏斗中,加入100mL乙醚,轻轻摇动,排气后盖好瓶塞,室温下振荡约10min后静置分层,将水相转入另一500mL分液漏斗中,按上述方法进行第二次萃取。合并醚液,用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水,滤液收入500mL圆底烧瓶中,于旋转蒸发仪上在50℃±2℃充氮条件下蒸至近干(绝不允许蒸干)。残渣加入适量乙醇,超声波提取溶解,将乙醇转移到25mL容量瓶中,用乙醇洗涤圆底烧瓶数次,洗涤液全部转移到同一25mL容量瓶中,用乙醇定容至刻度,摇匀,过滤,即得供试品溶液。
2.3.5.3测定
待仪器稳定后,分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL,注入液相色谱仪,测定。
3.数学模型
式中: X―样品中维生素A的含量,mg/100g;
M―样品的质量,g;
V―样品的稀释体积,mL;
C―样品溶液中维生素A的浓度,μg/mL。
由实验过程和数学模型可以看出,影响维生素A测定结果的不确定度因素有:除了样品的质量,样品的稀释体积, 样品溶液中维生素A的浓度之外,还有高效液相色谱仪进样的重复性,样品处理过程的一致性和高效液相色谱仪积分面积重复性等因素对测定结果产生影响。故不确定度的来源可以归纳为以下几个方面:
3.1重复测定导致的不确定度ur(1):包括样品处理过程的一致性所产生的不确定度;
3.2高效液相色谱仪所产生的不确定度ur(2):包括进样的重复性、液相色谱仪积分面积重复性所产生的不确定度;
3.3样品称量所产生的不确定度ur(3);
3.4样品定容体积所引入的不确定度ur(4):包括容量瓶体积所产生的不确定度;温度变化所产生的不确定度;内标溶液加入体积的不确定度;
3.5标准溶液配制所引入的不确定度ur(5):包括标准溶液配制过程中容量瓶体积产生的不确定度;稀释5个不同浓度标准溶液过程中刻度吸管所产生的不确定度;内标溶液加入体积所产生的不确定度;温度变化所产生的不确定度;
3.6标准溶液浓度校正所产生的不确定度ur(6):包括紫外分光光度计产生的不确定度;温度变化产生的不确定度;校正标准溶液浓度时所使用的移液管、容量瓶所产生的不确定度;
3.7由于标准溶液的浓度由吸光度来校正,且内标溶液的浓度对测量结果不产生影响,故维生素A对照品的称样量及纯度,芘内标物的称样量及纯度,均不参与评定。
4.各分量不确定度评定
4.1重复测定导致的不确定度ur(1)
4.1.1样品处理过程的一致性,采用平行测定10次的结果进行评定,属于A类评定,按照实验方法对样品平行测定。结果如下:
维生素A含量测定的标准偏差为:
1.231
标准不确定度: u(4.1.1)===0.3893
相对标准不确定度为: ==0.4768%
4.2高效液相色谱仪所产生的不确定度ur(2)
4.2.1进样的重复性,液相色谱仪积分面积重复性,采用同一个样品重复进样10次, 以维生素A和芘的峰面积的比值来进行评定(n=10)。属于A类评定。结果如下:
维生素A和芘的峰面积比值的标准偏差为:0.007773
标准不确定度: u(4.2.1)= ==0.002459
相对标准不确定度为:ur(2) ===0.2014%
4.3样品称量所产生的不确定度ur(3)
4.3.1使用XP-205分析天平进行称量,天平的校准证书给出的测量结果示值误差的扩展不确定度U=0.06mg,k=2,属正态分布,样品的称样量m=105.77mg,则有:
标准不确定度为:
相对标准不确定度为:ur(3)=
4.4样品定容体积引入的不确定度ur(4)
4.4.1样品定容过程只用到25mL的容量瓶,由25mL容量瓶的校准证书可知,这些容量瓶都属于A级,测量结果的扩展不确定度U=0.01mL,k=2,属于正态分布,则有:
标准不确定度为:u(4.4.1)===0.005mL
相对标准不确定度为:ur(4.4.1)==0.02000%
4.4.2由于本实验室温度在20±5℃的范围内波动,假设温度变化为5℃,该温度引起的不确定度可通过估算温度范围和体积膨胀系数计算,液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀,故只考虑前者即可。设温度为矩形分布,换算系数为,水的膨胀系数为/℃,则有:相对标准不确定度为:ur(4.4.2)=5××100%=0.06063%
4.4.3样品溶液中内标溶液的加入只用到3mL的单标线吸量管,由校准证书可知,实验中所用的3mL单标线吸量管,属于A级,测量结果的扩展不确定度U=0.002mL, k=2,属于正态分布,则有:标准不确定度为:u(4.4.3)== =0.001mL
相对标准不确定度为:ur(4.4.3)==0.03334%
则,样品定容体积所引入的不确定度ur(4),为ur(4.4.1)、ur(4.4.2)和ur(4.4.3)的合成,即:
4.5标准溶液配制所引入的不确定度ur(5)
4.5.1标准溶液配制过程中,需要用到5个25mL的容量瓶。参照4.4.1中相对标准不确定度的计算方法,则有:标准不确定度为:u(4.5.1)===0.005mL
相对标准不确定度为:ur(4.5.1)=5=0.1000 %
4.5.2 移取标准溶液所用的5mL刻度吸管,从校准证书可知,该刻度吸管属于A级,吸量结果的示值误差为:0~1mL为0.010mL,1~5mL 皆为0.014mL,按三角分布转化成标准不确定度。配制过程中,分别移取了0.5mL、1mL、2mL、3mL、5mL。则5mL刻度吸量管所产生的不确定度为5次移取标准溶液的标准不确定度的合成,即:
ur(4.5.2)=
4.5.3对照品溶液中内标溶液的加入所产生的相对标准不确定度,可参照4.4.3,则有:
标准不确定度为:u(4.5.3)===0.001mL
相对标准不确定度为:ur(4.5.3)=5=0.1667%
4.5.4温度变化带来的体积不确定度,同4.4.2,则有:ur(4.5.4)=0.06063%。
标准溶液配制所引入的不确定度ur(5),为ur(4.5.1)、ur(4.5.2)、ur(4.5.3)和ur(4.5.4)的合成,即:
4.6标准溶液浓度校正时所引入的不确定度ur(6):
4.6.1用紫外分光光度计对标准溶液浓度进行校正,测得吸光度A=0.4376;紫外分光光度计的校准证书给出的测量结果示值误差的扩展不确定度U=0.005,k=2,属正态分布,则有: 标准不确定度为: u(4.6.1)==
相对标准不确定度为:ur(4.6.1)=
4.6.2温度变化带来的体积不确定度,同4.4.2,则有:ur(4.6.2)=0.06063%
4.6.3校正标准溶液浓度时所产生的不确定度分别为:
4.6.3.1 1mL单标移液管:由校准证书可知,实验中所用的1mL单标移液管,属于A级,测量结果的扩展不确定度U=0.002mL, k=2,属于正态分布,则有:
标准不确定度为:u(4.6.3.1)===0.001mL
相对标准不确定度为:ur(4.6.3.1)==0.1000%
4.6.3.2 50mL容量瓶:由50mL单标线容量瓶的校准证书可知,实验中所用的50mL单标线容量瓶,属于A级,测量结果的扩展不确定度U=0.02mL, k=2,属于正态分布,则有: 标准不确定度为:u(4.6.3.2)===0.01mL
相对标准不确定度为:ur(4.6.3.2)==0.02000 %
所以该项的不确定度ur(4.6.3),为ur(4.6.3.1)和 ur(4.6.3.2)的合成,即:
则标准溶液浓度校正所引入的不确定度ur(6),为ur(4.6.1)、ur(4.6.2)和ur(4.6.3)的合成,即:
4.7合成标准不确定度评定,将上述不确定度分量列表如下:
合成标准不确定度:
5.扩展不确定度评定
扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子,取置信概率p=95%,则k=2,因此样品中的维生素A含量测定的扩展不确定度为:
U=k×ur(x)=2×0.9214%=1.843%
6.测量不确定度的结果与表示
不确定度结果:U(X)= 81.66 ×1.843%= 1.51 mg/100g
样品中维生素A的含量:W= 81.66±1.51 mg/100g
7.讨论
从表3可以看出,维生素A含量测定的不确定度因素中,影响最大的是标准溶液浓度校正、标准溶液配制和方法总重复性,影响最小的是高效液相色谱仪、样品定容体积和样品称量等产生的不确定度。因此提示在今后的含量检测过程中,要注意标准溶液浓度校正,要选用高校准级别的容量瓶和单标移液管,还要对紫外分光光度计进行定期的检定与维护保养。而且要求分析人员熟练掌握样品的各项处理步骤,以提高检测准确性。
参考文献:
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为准确掌握工作面支架受力情况及顶板来压情况,在工作面均匀布置了20个矿压观测点,重点观测工作面支架阻力随工作面推进变化,得出工作面周期来压步距,由顶板压力动态曲线图分析顶板来压强度,本次报告分析从2月26日至3月25日,本月共推进171米。
2、矿山压力分析报告
本报告在工作面5#、10#、15#、20#、25#、30#、35#、40#、45#、50#、55#、60#、65#、70#、75#、80#、85#、90#、95#、100#支撑状态较好及矿压显现规律较强的20架对3月份顶板动态压力进行分析。由图可知,2月27日-3月1日、3月10日-3月13日、3月17日-3月20日工作面支架压力显示波动频繁,幅度也较大,压力表最大为44MPa。表明工作面平均每两天顶板周期来压一次,由此确定90101工作面周期来压步距为15米。
3、工作面压力分析及来压后采取的措施
来压期间,工作面煤质较软,压力较大,作业时必须注意顶板支护和煤帮的管理。当工作面出现周期来压时,割煤后,及时移架支护,严格执行“敲帮问顶”制度,不得空顶作业,工作面上下端头出口高度不得低于1.8米,出口必须保持清洁、畅通。如出现断梁折柱、底板鼓起、片帮等现象时,必须进行处理。当上、下隅角处采空区压力过大时,必须采用戗柱或架设π型梁加强支护。严格按照《90101综采面回采作业规程》规定作业。
4、科室建议
(1)每周二生产科专职人员对周期来压时间进行确认,及时反馈至综采队,综采队根据周期来压时间加强支护,及时移架,保证工作面工程质量,防止架前冒顶。
(2)要求生产科与综采队在做好日常监测的同时,每周五安全检查时,抽调生产科与综采队维修专职人员,组成顶板联合监测组对90101运输、回风顺槽顶板重点进行监测,发现隐患及时上报并现场安排维修组进行处理,确保顶板安全。
股骨干骨折合并同侧股骨颈基底部骨折治疗的难度较大,以往多采用切开复位、分段固定的方法,创伤大、出血多,且固定不可靠。我院自2000年4月份至2006年12月份,采用股骨重建钉治疗股骨干合并同侧股骨颈基底部骨折7例取得较好疗效。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组7例,其中男5例、女2例。年龄:27~45岁,平均36岁,均为交通伤,闭合性骨折,股骨干骨折中上段5例、中下段2例,均为粉碎性骨折。股骨颈基底部骨折Garden分型Ⅲ型5例,Ⅳ型2例,合并上肢骨折2例,血气胸2例,脑挫裂伤2例,下颌骨折1例,脾破裂1例,受伤至手术时间为3~11天,平均7天。
1.2 手术方法 患者入院后均行骨牵引,复合伤请有关科室处置,完善相关检查,摄患侧、健侧股骨全长X光片,待病情平稳后手术治疗。连硬麻醉,病人取平卧位,伤髋下软枕垫高约20~30cm,消毒铺巾,内收患肢,于大转子上方作长约6cm切口,逐层分离,辨认梨状窝于该处紧贴大转子内侧皮质,保持与股骨干轴线平行扩口,φ8mm髓腔锉开扩髓依次加大至比术前X光片测量选定直径大1mm,用选定型号重建钉推入股骨髓腔近端,将股骨骨折闭合复位(如有困难采用小切口持骨器把持复位),保持力线正常,击入重建钉,并根据近端瞄准器水平保持前倾角10~15度。先安放近端锁钉,再将股骨颈骨折闭合复位,锁定股骨颈锁钉。
1.3 术后处理 术后持续皮牵引,第三天可坐起,并进行股四头肌功能锻炼,2~3个月后扶拐离床,根据X线片示骨痂生长情况,决定部分负重及完全负重时间。
2 结果
7例患者术后获16~28个月,平均22个月随访,完全负重时间为18~24个月,平均21个月,5例患者于术后20周改为动力固定,骨折全部愈合,愈合时间为6~18个月,平均11个月。1例患者因术中操作不当,股骨锁钉距股骨颈上方皮质过近,术后固定不可靠,导致术后20天股骨颈锁钉切割入关节,内固定失败,重新手术后获愈合。所有患者无髋内翻及成角畸形,无主钉折弯及断裂,根据sanders功能评分标准,评定疗效优4例、良2例、差1例。
3 讨论
股骨干骨折合并同侧股骨颈基底部骨折是一种罕见的高能量损伤,以往的内固定材料无法同时坚强固定两处骨折,治疗上往往顾此失彼,且传统切开复位创伤大失血多,骨折愈合时间长,并发症多,髓内钉固定为中轴性固定,属于应力分享式固定,应力遮挡小,后期改为动力固定,更是最大限度地减少应力遮挡,有利于骨痂的塑形,且可以同时达到两个骨折部位的坚强固定。
3.1 诊断 对于严重高能量损伤导致的股骨干骨折,伴有同侧髋关节肿胀疼痛,应常规摄髋关节正位片,以免股骨颈骨折漏诊。
3.2 骨折的复位 闭合复位具有切口小,失血少,感染率低,及有利于骨折愈合等优点,为首选复位方法,但不可强求,为保护手术人员身体健康,降低放射性损伤,减少手术时间,闭合穿钉时间大于30分,可采用小切口开放复位。关于复位的顺序,因为股骨的完整性、连续性遭到破坏,牵引下无法完成股骨颈骨折复位所需的旋转动作和必要的牵引力,所以我们先将股骨干骨折复位以恢复其完整性、连续性。先安放下端锁钉,防止其再移位,然后整复股骨颈骨折,安放近端锁钉。
3.3 静力固定与动力化 静力固定不允许髓内钉在骨干内滑动,控制了轴向短缩与旋转,但增加了应力遮挡,早期负重可导致锁钉折断。动力化后可增加骨折处的轴向负重,从而增加骨折愈合机会。本组患者由于为粉碎性骨折,早期全部采用静力固定,5个月复查X光片,示骨痂生长良好后改为动力性固定。但需注意过早的动力化可能导致肢体短缩。
3.4 并发症分析 本组1例病人术后20天出现上段锁钉切割入关节,导致内固定失败,主要是术中操作时,髓内钉击入稍浅导致股骨颈锁钉位置靠上,最上方一枚锁钉拧入时即部分穿过股骨颈皮质,术后外固定不可靠,断端间反复微动最后导致锁钉穿出。所以打入髓内钉时,应根据锁孔的位置和锁钉的进钉角度不断调整主钉进钉深度,以确保两枚锁钉完全穿入股骨颈骨质内。
C-反应蛋白(CRP)是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的一种急性时相蛋白,在炎症开始数小时CRP就升高,48小时可达峰值,随着病变消退、组织、结构和功能的恢复降至正常水平[2-3]。随着hs-CRP使用的推广, 越来越多的临床实验室开始开展该项目的检测。现对我科新购入的用于检测该项目的 Nephstar PLUS特定蛋白分析仪作一个在hCRP检测方面的性能分析。
1.材料与方法
1.1仪器与试剂 深圳国赛Nephstar PLUS特定蛋白分析仪及其配套试剂。
1.2试验样本:随机抽取当日门诊病人EDTA-K2抗凝血数支;深圳国赛超敏C-反应蛋白高值标准品,产品批号:1130-J05,靶值:147mg/L;深圳国赛超敏C-反应蛋白质控品,批号:0212032851 范围:16.333~24.500 mg/L。
1.3方法
1.3.1精密度试验 取三份新鲜全血,要求其hs-CRP值分别在1.00~10.00 mg/L,10.00~100.00 mg/L,100.00~200.00 mg/L这三个范围内。严格按照仪器说明的操作规程在Nephstar PLUS特定蛋白分析仪上各检测20次,总检测时间控制在1小时之内,计算其均值,SD值和CV值。
1.3.2准确度评估 取深圳国赛超敏C-反应蛋白高值标准品和深圳国赛超敏C-反应蛋白质控品各一支,严格按照试剂说明书对标准品和质控品进行前处理,在Nephstar PLUS特定蛋白分析仪上对此两支标本分别进行检测,比较质控品检测值是否落在其要求范围内,以标准品的定值为靶值,计算检测系统的偏倚。
1.3.3 线性范围验证 仪器说明书给出的线性范围为1.0~350mg/L,现用以下方法对此参考范围进行验证。取一份靶值为296mg/L的标准品,按7(标准品):3(样本稀释液) 的比例将其稀释成207.2mg/L的浓度作为基准液。该基准液在全血模式下的理论检测结果为:207.2*5/3=345.3mg/L。将基准液按1:1、1:3、1:9、1:99和1:399的比例进行稀释,配制成50%、25%、10%、1%和0.25%的稀释度。每个稀释度在全血模式下重复测定2次,计算均值。将实测值与理论值作比较,计算 y=ax+b,和相关系数R2,验证其线性范围。
1.4 统计学分析 运用Microsoft Excel V11软件和SPSS10.00统计分析软件处理。
2.结果
2.1 精密度试验结果 三份不同hCRP浓度的全血标本的重复性试验结果见表1。此结果表明:高、中、低三个浓度的hCRP检测的批内CV%均小于5%,即精密度良好。
表1 批内精密度(n=20)
标本 平均值X(mg/L) 标准差SD(mg/L) 变异系数CV(%)
高值 129 3.199 2.48
中值 54.32 1.994 3.67
低值 2.68 0.113 4.21
2.2 准确度评估 质控品检测结果为19.546mg/L,落在其要求范围(16.333~24.500 mg/L)内。标准品(靶值147mg/L)检测结果为152.377 mg/L,偏差为3.7%,在可接受范围内,即准确度良好。
2.3 线性范围验证结果 见表2和图1。结果经统计分析得出理论值和实测值之间的线性方程为y =0.9707x+0.4804,两者间的相关系数R2为0.9992,即理论值与实测值之间相关性良好,线性范围验证通过。
表2 线性稀释结果
理论浓度(mg/L) 实际浓度(mg/L)
1 2 X
172.65 177.376 181.302 173.45
86.325 88.436 90.023 86.849
34.53 35.077 36.158 33.996
3.453 3.062 3.213 2.911
0.863 0.394 0.398 0.39
3.讨论
hs-CRP已被证实是由慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素,超敏CRP的检测工作也已在各医院临床实验室内得到广泛的开展。但由于对此项目的检测国家并没有出台相应的标准,也没有相关的室间质评作为项目检测方法是否合格的评估,因此,实验室内对超敏CRP检测系统的验证就尤为重要。
本文的研究分析得到,Nephstar PLUS特定蛋白分析仪检测高、中、低三个浓度的hCRP检测的批内CV%均小于5%,即精密度良好。而在准确度的评估上,质控品检测结果为19.546mg/L,落在其要求范围(16.333~24.500 mg/L)内。标准品(靶值147mg/L)检测结果为152.377 mg/L,偏差为3.7%,在可接受范围内,说明准确度良好,符合临床上使用要求。在线性范围验证的实验上,以207.2mg/L的浓度作为基准液,将其稀释成5个不同浓度,计算理论值分别为172.65 mg/L、86.325 mg/L、34.53 mg/L、3.453 mg/L、0.863 mg/L,用Nephstar PLUS特定蛋白分析仪检测hCRP的实际浓度两次,计算平均值,根据数据得出线性方程为y =0.9707x+0.4804,两者间的相关系数R2为0.9992。说明理论值与实际值的相关性强。
以上实验表明,深圳国赛Nephstar PLUS特定蛋白分析仪在超敏CRP检测方面,精密度和准确度均良好,厂家仪器说明书提供的线性范围也验证合格,能达到临床实验室工作的要求,可正常使用。
参考文献
荧光增白剂(Fluorescent whitening agents,FWA)是一种荧光染料,常被用于纸、塑料等行业的生产中,以提高产品的白度和艳度。鉴于荧光增白剂可能通过食品包装迁移到食品,被人体吸收后会对人体造成危害,各国对荧光增白剂进行了监管,制定了允许用于生产食品接触材料的荧光增白剂清单,如欧盟2002/72/EC[1]列出了FWA 393, FWA 184, FWA 236和FWA 368等塑料用荧光增白剂,并明确规定食品包装纸最终产品的荧光增白剂的限制为“检测不到该物质迁移到食品中的量”[2];我国列出了FWA 393, FWA 184和FWA 236 3种塑料用荧光增白剂[3], 同时规定纸包装产品“生产过程中不得使用荧光增白剂”[4]。因此,建立食品接触纸包装材料中荧光增白剂的快速定性与定量检测方法,有利于对可能存在的违禁添加荧光增白剂行为进行监管。
目前,常用的荧光增白剂的检测方法有紫外灯照射观测法(ULO)[5]、薄层层析法(TLC)[6]、液相色谱法(HPLC)[6,7]和液相色谱串联三重四级杆质谱法(LCMS/MS)[7,8]等。ULO、TLC和HPLC的方法灵敏度和选择性较差;LCMS/MS采用MRM模式检测,灵敏度高,抗干扰能力强,但仍受分辨率、扫描速率和模式的限制,不能满足快速筛查的需求。高效液相色谱串联高分辨飞行时间质谱(LCTRIPLETOF)不仅具备了高分辨飞行时间质谱能测得化合物及其碎片离子的分子式和精确分子量数据的特性[9~11],同时具备完全定性、同时定性定量、完全定量3种(Triple)工作流程,在LCTRIPLETOF的TOF MS触发TOF MS/MS的模式下检测,可以根据保留时间、一级离子质量准确度、一级离子同位素分布、二级碎片与谱库匹配4种手段准确定性,具有高分辨率、高灵敏度和高扫描速度等特点[12]。目前尚未见应用LCTRIPLETOF分析荧光增白剂的报道。
本研究采用液相色谱串联高分辨飞行时间质谱技术,以食品接触纸包装材料中FWA368, FWA367, FWA185, FWA184, FWA52, FWA135和FWA393(结构图见表1)7种荧光增白剂为研究对象,建立了7种荧光增白剂的MS/MS数据库,并通过优化前处理方法和色谱质谱条件,建立了食品接触纸质包装材料中荧光增白剂的定性确证及定量检测方法。 2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1 Commission Directive 2002/72/EC
2 Santos M, Batlle R, Salafranca J, Nerín C. J. Chromatogr. A, 2005, 1064: 135-141
3 GB 96852008, Hygienic Standards for Uses of Additives in Food Containers and Packaging Materials. National Standards of the People′s Republic China
食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准. 中华人民共和国国家标准. GB 96852008
4 The Detailed Rules for the Implementation of the Production License of Food Contact Paper Package, Containers and Other Products. Beijing: General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People′s Republic of China, 2007
食品用纸包装、容器等制品生产许可实施细则. 北京:国家质量监督检验检疫总局, 2007
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Simultaneous Determination of Seven Fluorescent Whitening
Agents in Food Contact Paper Package Materials by
High Performance Liquid Chromatography Tandem
Triple TOFHigh Resolution Mass Spectrometry
DU ZhiFeng1,2,4, XIAN YanPing1, LIU FuJian3, GUO XinDong*1, HUANG JinFeng1,
WU YuLuan1, LUO HaiYing1, WANG YongHua*4
1(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou 510110, China)
2(AB SCIEX Asia Pacific Application Support Center, Shanghai 200233, China)
3(Guangdong Testing Institute for Product Quality Supervision, Guangzhou 510330, China)
4(College of Light Industry and Food Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
依照《中华人民共和国合同法》及其他有关法律、行政法规,遵循平等、自愿、公平和诚实信用的原则,双方就本鉴定工程事项协商一致,订立本合同。
一、 房屋鉴定工程概况
(一)房屋名称:
(二)房屋地址:
(三)房屋鉴定原因:
二、房屋鉴定工程范围
(一)甲方工作内容:
1、向乙方提交《鉴定委托书》及以下资料(已提交的打“√”):
(1)甲方身份证明材料;
(2)房屋所有权证、租赁合同、代管或者托管协议;
(3)房屋设计资料;
(4)地质勘察资料;
(5)施工技术档案;
(6)房屋目前使用用途证明;
(7)提供相邻房屋的相关材料。
2、乙方因检测鉴定需要要求甲方提供的其他技术资料:
3、应于 年 月 日提供上述资料,并对其完整性、正确性及时限负责;
甲方不得要求乙方违反国家有关标准进行检测鉴定。
4、提供鉴定现场的水源、电源及鉴定所需的工作面;
5、提供现场检测的安全措施;
(二)乙方工作内容:
1、调查摸清房屋的历史和现状;
2、现场查勘、测试,记录各种数据和状况;
3、检测、验算,整理技术资料;
4、全面分析,论证定性,作出综合判断;
5、出具《房屋安全鉴定报告书》(检测鉴定报告应包括相应的检测数据);
6、将《房屋安全鉴定报告书》提交甲方,由甲方向 市(区、县)建设、房地产行政主管部门办理《房屋安全鉴定报告书》(一式五份)备案;
7、对鉴定报告中提出需加固、结构补强的,提供技术咨询;
三、合同工期
(1)本合同签订后三日内,乙方必须进行现场查勘(指乙方工作内容的第1、2条);如因甲方原因造成乙方不能进驻现场,现场查勘时间顺延;有明显险情的房屋,乙方应于 年 月 日立即组织鉴定;
(2)乙方在开始现场查勘且甲方提交全部所需资料后 个工作日内,出具鉴定报告;
(3)房屋结构复杂、鉴定难度较大,在规定的时间内不能完成鉴定的,应当向甲方说明情况,另行签定补充协议,并根据实际情况出具阶段性鉴定文件。
四、质量标准
房屋安全鉴定主要依据国家行业标准《危险房屋鉴定标准》、国家标准《民用建筑可靠性鉴定标准》、《工业厂房可靠性鉴定标准》以及相关的国家、地方专业技术标准、规范和规程,以及建设部《城市危险房屋管理规定》。乙方应根据具体工程实际情况,确定检测依据及标准。
五、 收费标准、鉴定面积、合同价款
(一)房屋安全鉴定费用:可按每平方米鉴定建筑面积 元计收。
(二)鉴定总面积: 平方米。
如果实际鉴定建筑面积与上款面积不符,则以实际鉴定建筑面积为准,并调整鉴定费用。
(三)鉴定费用总金额¥: 元(不含检测、勘察费用)
(大写): (人民币)
六、付款方式
(一)甲乙双方签订本合同后 天内,甲方付给乙方合同总金额的 % 。属财政出资的,甲方可先行垫付。
(二)甲方收到乙方提交的《房屋安全鉴定报告书》后,甲方配合乙方办理财政支付的相关手续,并结算合同价款。
(三)甲方自行出资的其他方式:
七、组成合同的文件
八、双方责任
(一)甲方
应提交乙方的全部所需资料超过规定期限 天以内,乙方按本合同第三条规定交付鉴定报告的时间顺延;甲方交付上述资料超过规定期限 天以上时,乙方有权重新确定提交鉴定报告的时间。(不能提供主要资料的,乙方有能力通过检测等技术手段完成鉴定的,可约定)
(二)乙方
1、未按合同工期提交报告时,每延误一天,罚款300元。
2、负责鉴定报告的质量。因弄虚作假、计算错误等乙方原因导致鉴定报告的鉴定结论与建筑物实际情况不符,造成经济损失及安全事故,应退还鉴定费用,免收受损失部分的检测鉴定费,并承担相应的法律责任。
九、有关事宜
(一)本合同执行过程中发生争议,甲乙双方应及时协商解决。如双方协商不成,经双方同意,可向市(区、县)建设、房地产行政主管部门申请调解。
(二)未尽事宜,经双方协商一致,签订补充协议。
(三)双方的协商补充条款、补充协议与本合同均具效力。
(四)本合同经甲乙双方鉴字盖章即时生效。
(五)本合同正本一式四份,甲乙双方及市、县建设局(房管局)各执一份。
甲、乙双方确定,在本合同有效期内,甲方指定 为甲方项目联系人,乙方指定 为乙方项目联系人,项目联系人负责本项目进行过程中的协调工作,以使本项目顺利进行。
十、 合同生效
合同订立时间: 年 月 日 合同订立地点:
本合同双方约定: 后生效; 后失效。
第二条本办法适用于全国河道(包括湖泊、人工水道、行洪区、蓄滞洪区)、灌排渠系、堤防(包括海堤)上依法修建的,由水利部门管理的大、中型水闸。
小型水闸、船闸和其它部门管辖的各类水闸参照执行。
第三条水闸实行定期安全鉴定制度。首次安全鉴定应在竣工验收后5年内进行,以后应每隔10年进行一次全面安全鉴定。运行中遭遇超标准洪水、强烈地震、增水高度超过校核潮位的风暴潮、工程发生重大事故后,应及时进行安全检查,如出现影响安全的异常现象的,应及时进行安全鉴定。闸门等单项工程达到折旧年限,应按有关规定和规范适时进行单项安全鉴定。
第四条国务院水行政主管部门负责全国水闸安全鉴定工作的监督管理。
县级以上地方人民政府水行政主管部门负责本行政区域内所辖的水闸安全鉴定工作的监督管理。
流域管理机构负责其直属水闸安全鉴定工作的监督管理,并对所管辖范围内的水闸安全鉴定工作进行监督检查。
第五条水闸管理单位负责组织所管辖水闸的安全鉴定工作(以下称鉴定组织单位)。水闸主管部门应督促鉴定组织单位及时进行安全鉴定工作。
第六条县级以上地方人民政府水行政主管部门和流域管理机构按分级管理原则对水闸安全鉴定意见进行审定(以下称鉴定审定部门)。
省级地方人民政府水行政主管部门审定大型及其直属水闸的安全鉴定意见;市(地)级及以上地方人民政府水行政主管部门审定中型水闸安全鉴定意见。
流域管理机构审定其直属水闸的安全鉴定意见。
第七条水闸安全类别划分为四类:
一类闸:运用指标能达到设计标准,无影响正常运行的缺陷,按常规维修养护即可保证正常运行。
二类闸:运用指标基本达到设计标准,工程存在一定损坏,经大修后,可达到正常运行。
三类闸:运用指标达不到设计标准,工程存在严重损坏,经除险加固后,才能达到正常运行。
四类闸:运用指标无法达到设计标准,工程存在严重安全问题,需降低标准运用或报废重建。
第二章基本程序及组织
第八条水闸安全鉴定包括水闸安全评价、水闸安全评价成果审查和水闸安全鉴定报告书审定三个基本程序。
(一)水闸安全评价:鉴定组织单位进行水闸工程现状调查,委托符合第十二条要求的有关单位开展水闸安全评价(以下称鉴定承担单位)。鉴定承担单位对水闸安全状况进行分析评价,提出水闸安全评价报告;
(二)水闸安全评价成果审查:由鉴定审定部门或委托有关单位,主持召开水闸安全鉴定审查会,组织成立专家组,对水闸安全评价报告进行审查,形成水闸安全鉴定报告书;
(三)水闸安全鉴定报告书审定:鉴定审定部门审定并印发水闸安全鉴定报告书。
第九条鉴定组织单位的职责:
(一)制订水闸安全鉴定工作计划;
(二)委托鉴定承担单位进行水闸安全评价工作;
(三)进行工程现状调查;
(四)向鉴定承担单位提供必要的基础资料;
(五)筹措水闸安全鉴定经费;
(六)其它相关职责。
第十条鉴定承担单位的职责:
(一)在鉴定组织单位现状调查的基础上,提出现场安全检测和工程复核计算项目,编写工程现状调查分析报告;
(二)按有关规程进行现场安全检测,评价检测部位和结构的安全状态,编写现场安全检测报告;
(三)按有关规范进行工程复核计算,编写工程复核计算分析报告;
(四)对水闸安全状况进行总体评价,提出工程存在主要问题、水闸安全类别鉴定结果和处理措施建议等,编写水闸安全评价总报告;
(五)按鉴定审定部门的审查意见,补充相关工作,修改水闸安全评价报告;
(六)其它相关职责。
第十一条鉴定审定部门的职责:
(一)成立水闸安全鉴定专家组;
(二)组织召开水闸安全鉴定审查会;
(三)审查水闸安全评价报告;
(四)审定水闸安全鉴定报告书并及时印发;
(五)其它相关职责。
第十二条大型水闸的安全评价,由具有水利水电勘测设计甲级资质的单位承担。中型水闸安全评价,由具有水利水电勘测设计乙级以上(含乙级)资质的单位承担。
经水利部认定的水利科研院(所),可承担大、中型水闸的安全评价任务。
第十三条水闸安全鉴定审定部门组织的专家组应由水闸主管部门的代表、水闸管理单位的技术负责人和从事水利水电专业技术工作的专家组成,并符合下列要求:
(一)水闸安全鉴定专家组应根据需要由水工、地质、金属结构、机电和管理等相关专业的专家组成;
(二)大型水闸安全鉴定专家组由不少于9名专家组成,其中具有高级技术职称的人数不得少于6名;中型水闸安全鉴定专家组由7名及以上专家组成,其中具有高级技术职称的人数不得少于3名;
(三)水闸主管部门所在行政区域以外的专家人数不得少于水闸安全鉴定专家组组成人员的三分之一;
(四)水闸原设计、施工、监理、设备制造等单位的在职人员以及从事过本工程设计、施工、监理、设备制造的人员总数不得超过水闸安全鉴定专家组组成人员的三分之一;
水闸安全鉴定专家组成员应当遵循客观、公正、科学的原则履行职责,审查水闸安全评价报告,形成水闸安全鉴定报告书。
第十四条流域机构、省级水行政主管部门应按年度汇总所管辖的大、中型水闸安全鉴定报告书,并于每年年底前报送水利部备案。
第三章工作内容
第十五条水闸安全鉴定工作内容应按照《水闸安全鉴定规定》(SL214-98)执行,工作内容包括现状调查、现场安全检测、工程复核计算、安全评价等。
第十六条现状调查应进行设计、施工、管理等技术资料收集,在了解工程概况、设计和施工、运行管理等基本情况基础上,初步分析工程存在问题,提出现场安全检测和工程复核计算项目,编写工程现状调查分析报告。
第十七条现场安全检测包括确定检测项目、内容和方法,主要是针对地基土和填料土的基本工程性质,防渗导渗和消能防冲设施的有效性和完整性,混凝土结构的强度、变形和耐久性,闸门、启闭机的安全性,电气设备的安全性,观测设施的有效性等,按有关规程进行检测后,分析检测资料,评价检测部位和结构的安全状态,编写现场安全检测报告。
第十八条工程复核计算应以最新的规划数据、检查观测资料和安全检测成果为依据,按照有关规范,进行闸室、岸墙和翼墙的整体稳定性、抗渗稳定性、抗震能力、水闸过水能力、消能防冲、结构强度以及闸门、启闭机、电气设备等复核计算,编写工程复核计算分析报告。
第十九条安全评价应在现状调查、现场安全检测和工程复核计算基础上,充分论证数据资料可靠性和安全检测、复核计算方法及其结果的合理性,提出工程存在的主要问题、水闸安全类别评定结果和处理措施建议,并编制水闸安全评价总报告。
第二十条水闸主管部门及管理单位对鉴定为三类、四类的水闸,应采取除险加固、降低标准运用或报废等相应处理措施,在此之前必须制定保闸安全应急措施,并限制运用,确保工程安全。
第二十一条经安全鉴定,水闸安全类别发生改变的,水闸管理单位应在接到水闸安全鉴定报告书之日起3个月内,向水闸注册登记机构申请变更注册登记。
第二十二条鉴定组织单位应当按照档案管理的有关规定,及时对水闸安全评价报告和水闸安全鉴定报告书等资料进行归档,并妥善保管。
第四章附则