白猫计划汇总十篇

序论：好文章的创作是一个不断探索和完善的过程，我们为您推荐十篇白猫计划范例，希望它们能助您一臂之力，提升您的阅读品质，带来更深刻的阅读感受。

篇（1）

此番银基牵手茅台被业内解读成丰富产品线，寻找新的盈利增长点，因为银基2012年中期财报披露，其净亏1.77亿港元，有近13亿港元的应收账款，营收同比下降85.4%。2011年同期，公司收入则高达16亿港元，有4.07亿港元的净利润，这是银基在香港上市4年以来提交的首份亏损财报。这种解读是正确的，但银基的亏损仅仅是其与茅台合作的诱因，而不是根本原因，根源在于银基所经销的五粮液系列、国窖1573系列、汾酒系列海外市场拓展不利，而海外市场拓展不利的根源在这些品牌的酒文化不被国外市场认同。因此，我认为银基牵手茅台折射出的是中国白酒的文化困局。

多年来，中国白酒拓展海外市场效果很不理想，这是公认的事实。并不是西方人不喝酒，也不是他们不习惯白酒的口感，而是不认可白酒的文化。洋酒在中国的成功证明了口感不是问题，文化才是根本。

笔者做过几次市场调研，喝洋酒的人，65%以上其实并不认为洋酒比白酒更好喝，他们喝洋酒不是冲着其口感，而是文化。比如，在北京经常出现这样的现象：中午在饭店喝白酒，晚上到夜店喝洋酒。如果在夜店喝白酒就会觉得怪怪的。是文化在背后起了作用。

酒是精神价值与物理价值高度统一的特殊商品，与其物理价值相比，酒的精神价值更加重要，而所谓的精神价值，主要是由酒文化构建和支撑的。因此，酒类品牌都在致力于打造自己的独特酒文化。白酒品牌也不例外。

但事实上，中国白酒的酒文化存在致命的缺陷。

一、白酒文化的根是农耕文明，不符合工业化、城市化大潮流

白酒已有几千年的历史了，但从仪狄造酒算起，或者从杜康酿酒开始，漫长的白酒发展史就是一部农耕文明发展史。在世界上最大规模农耕文明的养育下，中国白酒积淀起深厚的农耕文化气质。这种酒文化渗透到人们生活的方方面面，彻底与中国人的生活融为了一体。

但今天，中国进行着世界上最大规模的人口大迁徙，成亿的人口从农村走进城市。中国经济的重心也早已从农业转移到工业，并正在向服务业转移。同时，我们正赶上第三次工业革命，这次科技革命不仅极大地推动了人类社会经济、政治、文化领域的变革，而且也影响了人类生活方式和思维方式，使人类社会生活和人的现代化向更高境界发展。同时，第三次工业革命让世界变成了地球村，信息融通更加便捷。在这样的时代大背景下，统治中国的文明正由或者已经由农业文明变为工业文明，由农村文明变为都市文明。

做企业的都知道一个基本原则：随需而变。不同的文明孕育不同的文化，时代变了，市场需求自然也发生了变化，白酒文化自然也应该随之而变。但事实上，绝大部分的白酒企业依然走在农耕文明的老路上，依然在挖掘历史，依然试图用几百年前乃至几千年前的历史人物或故事去征服今天的消费者，在国内这么做，在国外仍然这么做。落后的文明自然会遭到先进文明的强烈排斥和打压，所以中国的白酒很难受到西方社会的认可。其实这点道理很容易想明白，即便仅仅是国内市场也早已经给了我们清晰的答案：文化修养越低的人白酒的消费量越大，文化修养越高的人白酒的消费量越小，白酒的消费量与消费者的文化修养正好成反比，这就是对我上面所言的最好证明。

说到这里，我们就很容易理解为什么综合素养越高的人越热衷于洋酒和葡萄酒了。同时，我们也就不难理解为什么白酒企业的营销总是那么粗放和笨拙了。根本上来说，白酒在国际市场上的失利是酒文化的失利，而不是口感、渠道和价格的失利。

二、白酒文化缺乏时尚基因

白酒表面的喧哗掩盖不了其守旧的本质，固守过去就意味着对现在的放弃，而现在就是与时俱进，就是时尚。

毫无疑问，这是一个比以往任何时候都更强调时尚的年代。追随时代的步伐，透析当下人们的价值观，并用产品和品牌去迎合和满足这种价值观需求，这就是时尚。在都市文明占统治地位的时代，在个性化成为标签的时代，白酒依然用农耕思维做产品和品牌，不懂时尚、不够时尚就是必然的了。

说到这里很多白酒企业会很不服气，特别是那些销量巨大的品牌。其实从白酒的产品和品牌传播中是很容易看到不够时尚这一缺陷的。

白酒的产品包装一个比一个奢华，但这种奢华总是透射着封建社会的审美观，总是带有强烈的暴发户的痕迹，生硬而肤浅。显得与时代格格不入。

品牌传播不是注重品牌文化的体验，而是过分依赖广告投入，依赖高度同质化的促销，依赖不太体面的买店等恶性手段。而时尚恰恰是一种身心体验，而不是广告和促销所能引导的。

这些都导致了极其严重的同质化竞争。

时尚和个性是一个硬币的两面，一个懂得时尚的品牌必然是一个充满个性的品牌，而时尚和个性恰恰是同质化竞争的天敌。要想让品牌具备时尚和个性气质，必然要走差异化的竞争路线，就像芝华士和黑牌、马爹利和轩尼诗一样。

不够时尚的白酒为什么在国内还能如此畅销？这个问题很好回答：一方面是几千年的消费惯性在起作用，这种惯性不是短期内能彻底改变的；一方面是有很大一批人处于两种文明的过渡真空期，这批人还没有形成或正在形成新的价值观，对时尚并没有什么深刻的理解，因此，白酒是否时尚对他们影响也不大。

三、不少企业对酒文化的理解有方向性偏差

不管大事小事，要想把事情做好，首先得理解这个事情的基本概念。比如想把人做好，就得理解人是什么，人为什么活着；想把品牌做好，就得搞明白品牌是什么，品牌对企业的价值是什么。同样，想打造极具市场影响力的酒文化，就得弄明白酒文化到底是什么，和消费者有什么关系，这种关系是怎样发生的。太多的企业认为这些问题过于简单而不去深入思考，恰恰是这种漠视，影响了企业对酒文化的判断和理解，最后出现方向性偏差。

误将酒文化等同于品牌文化

白酒的酒文化是一个复杂的系统，包含了太多的东西，但只有一个点是和消费者发生着直接的关系，就是酒文化所代表的价值观，这个严格意义上来说应该是品牌文化。品牌文化和酒文化最大的区别是：品牌文化是个市场化概念，它生发于消费者内心，是基于营销和竞争而生的；酒文化却不那么单纯，其构成的复杂性决定了它往往脱离市场而成为一种空幻的概念。

在卖方市场下可以不考虑品牌，因为消费者没得选择。但在买方市场下，不考虑品牌只有死路一条。在对品牌的理解上，白酒业与软饮料、电子、汽车等行业有着很大的差距。厘清品牌文化与酒文化之间的关系应该是白酒企业的首要任务。

误把酿造文化等同于品牌文化

酿造文化生发于生产，而品牌文化生发于市场，这是完全反方向的两个东西。我们看到不少企业喜欢拿酿造文化混同于品牌文化，最典型的就是搞出越来越多的香型。事实已经证明，这些花里胡哨的香型并不被市场买账。消费者关注的焦点并不是你的酒是怎么酿造出来的，而是你的酒是不是称了他的心，也就是你的品牌是不是和他有共同语言，价值观是否相同。酿造文化可以作为品牌文化的支撑点之一，用以帮助消费者更好的理解品牌文化，但绝不能等同于品牌文化，这将会给企业发展带来巨大阻碍。

误把历史等同于品牌文化

把历史等同于品牌文化是白酒业的又一大特色。在中国，掘历史的坟墓最彻底的不是小说家，不是电影人，不是史学家，而是白酒企业。不管大小，每一个白酒企业都能说出一大堆的历史故事。但真正能流传开来的却极少极少，如果放到大众消费者身上，能流传的白酒故事恐怕也只有“李白斗酒诗百篇、牧童遥指杏花村”等进了教科书的可怜的几个了吧。

历史的车轮是滚滚向前的，关注今天和明天是人们的常性，关注过去只是生活的附带，即使仅仅是附带的回顾一下历史，也是为了更加清楚的认识现在和未来。如果一个企业把历史当做自己关注的主要焦点，必然会忽略对现在和未来的解读。这或许是白酒品牌多缺乏时尚感和国际竞争力的根源吧。

篇（2）

1引言

转铁蛋白（Trf）是脊椎动物体中一种非血红素结合铁的馇虻鞍祝捎胂赴ど系rf受体结合，内吞化形成内吞小体。在特定信号介导下，Trf可以通过释放铁离子，转移出细胞膜外。由于恶性肿瘤细胞过度表达Trf受体，因此，通过标记Trf可进行肿瘤细胞的识别、诊断和治疗研究[1，2]。量子点作为一种新型荧光材料，近年来在生物成像研究中快速发展，特别是在细胞可视化研究方面[3～11]。量子点用于细胞标记一般需将量子点与靶蛋白偶联，再通过靶蛋白结合在细胞膜或进入胞内显示量子点的荧光，由此进行靶蛋白在细胞膜及胞内的定位及成像分析。因此靶蛋白与量子点的偶联体系的构建是量子点生物成像应用的基础。

本研究选取Trf为靶蛋白，通过其与细胞膜上的Trf受体结合，进而转运靶蛋白量子点的偶联物。目前，量子点与蛋白质的偶联多采用生物素亲和素法、共价法及静电吸附法等。蛋白质与量子点偶联时，二者的混合比例决定偶联产物的质量以及生物功能化的效果。在量子点与蛋白质的偶联反应中建立高效、快速、低成本方法进行表征，对于偶联体系的优化，提高偶联效率非常必要。本研究利用毛细管电泳激光诱导荧光法（CELIF）的高效、快速、高灵敏和样品用量少等优势，对Trf与量子点CdTe偶联的方法和条件进行快速优化，并将得到的CdTeTrf偶联物不经分离而直接用于Hela细胞标记。通过激光共聚焦显微镜进行标记效果的成像观察。实验结果表明， CdTeTrf偶联物具有Trf的生物功能，并能特异性识别细胞膜表面的Trf受体，在其介导下可转运到Hela细胞内，分布在胞质中。CELIF法也适用于其它荧光纳米材料的表面功能化效率表征，包括偶联剂种类的选择和反应比例的优化、偶联产物的性质表征等，具有一定的通用性。

3结果与讨论

采用CELIF进行偶联条件优化可得到偶联产物的定性与定量信息，如荷电性质、荷质比、荧光强度、稳定性等，有助于最佳条件的判断和选择。

3.1偶联剂活化后量子点的表征

因所用量子点是以巯基乙酸为稳定剂在水相中合成而得，故量子点表面包覆着一层羧基，而量子点与Trf的偶联则通过量子点表面的羧基与蛋白质表面的氨基间的酰胺反应完成。NHS和EDC为常用的亚胺偶联剂，实验中对比了以NHS及NHS和EDC混合偶联剂（EDCNHS）活化的量子点性能（图1）。

由图1a可见，以单一偶联剂NHS活化的量子点其荧光强度高且峰形尖锐，说明单一偶联剂NHS活化的量子点粒径均一，有利于减少量子点表面缺陷，增强量子点荧光效率。当使用混合偶联剂活化时，量子点的峰形较宽，峰强度较低（图1b），说明混合偶联剂可能导致量子点的稳定性降低，量子点间产生一定程度的团聚。导致其峰高降低，峰展宽。对比图1a和图1b可见，单一偶联剂NHS活化后量子点性能好于混合偶联剂EDCNHS活化的量子点。因此后续实验均采用NHS偶联剂对量子点进行活化[12，14]。

3.2量子点偶联Trf的条件优化

NHS的存在使Trf可有效的偶联于CdTe表面，形成类似核壳结构的CdTeTrf偶联产物。由图2A第一个电泳图可见，产物峰（3.3 min）相对于活化后的CdTe（图1a， 6.3 min）迁移时间缩短，即量子点偶联蛋白后迁移加快，说明Trf确实已偶联于CdTe表面，且偶联产物表面电荷性质以及整体的荷质比更接近于蛋白质的迁移时间（约3.0 min）。因此说明不同Trf浓度下形成的偶联产物均以CdTe为核，以Trf为壳，呈现为核壳复合物。

随偶联蛋白Trf浓度的增加，偶联产物的荧光强度变化如图2B。当Trf的浓度低于31.2 olL时，随Trf的浓度增加，偶联产物荧光强度明显增强。说明包覆于表面的Trf对CdTe表面的晶格缺陷有所改善。Trf的包覆量越多，CdTe表面越完善，荧光强度越高。但当Trf浓度高于31.2 olL，荧光强度转而开始下降。说明偶联反应在31.2 olL时已达饱和，CdTe表面完全被Trf包覆，而溶液中过量的游离Trf不仅对功能化的量子点有一定的荧光猝灭作用，而且在后续偶联体系标记细胞时，游离的Trf将与偶联产物CdTeTrf一起竞争细胞上的Trf受体靶标，严重干扰CdTeTrf对细胞表面Trf受体的标记。因此，采用CELIF法对量子点偶联条件进行优化，简单快速，可明确判断蛋白质是否偶联于量子点表面，更有利于严格控制Trf与CdTe的反应比例，提高偶联效率和细胞标记效果，后续标记时不需要对偶联体系的产物进行分离纯化。由于Trf浓度增高，会使溶液粘度增加，导致电泳峰展宽，因此采用峰面积考察荧光强度变化。

篇（3）

研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达FimA蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体提供实验基础。

研究方法：1. 以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为宿主菌，用IPTG诱导fimA表达，通过SDS-PAGE和Western blot来验证蛋白的表达结果，并进行蛋白表达形式分析。2. 大量诱导表达融合蛋白，用Co2+柱亲和层析纯化表达产物，通过SDS-PAGE和Western blot来验证纯化产物，纯化产物经透析复性后用BCA法蛋白定量试剂盒作蛋白含量测定。

研究结果：1. 经IPTG诱导表达后，工程菌在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约41kDa），IPTG浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当IPTG浓度为2 mmol/L，诱导时间为3 h时蛋白表达量最大；当IPTG浓度为1 mmol/L，诱导时间为1 h时蛋白表达量最小。6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。2. 表达产物经Co2+柱亲和层析， SDS-PAGE上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa）。6×His-FimA纯化产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经BCA法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的FimA蛋白浓度为0.96 mg/ml。

主要结论：用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因能够得到正确表达。表达产物经Co2+柱亲和层析，可以得到带6×His标签的FimA融合蛋白。

1 绪论

慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的，一旦发生，目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长，对牙周健康状况的关注日益提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提高国民健康水平具有重要意义。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效的防治疾病的手段。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到DNA疫苗，由于技术不断改进，使得疫苗有了广泛的应用，被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。

慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis， Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是其主要亚单位，能够介导Pg对宿主组织的粘附与入侵，以及与口内其他细菌的粘附共聚[1-3]，还能刺激炎性因子的产生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而无菌毛的突变菌株则不会造成牙槽骨的破坏。也有实验发现，用FimA免疫大鼠可减轻由Pg引起的牙槽骨破坏[5]，将抗FimA的单克隆抗体用于口腔被动免疫，可以抑制该菌在口腔的定植[6]。因此，可以将FimA作为防治牙周炎疫苗抗原。

Pg菌毛的单体是FimA，由单拷贝fimA基因编码。fimA基因全长1290 bp，开放读框包括1044 bp，编码347个氨基酸。翻译后产物菌毛蛋白的功能域（如刺激T细胞和B细胞的位点、刺激细胞因子产生的位点等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各个位点之间可相互交叉或覆盖。近年来由于分子生物学和免疫学的发展，fimA基因已被克隆和测序，对蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位已有了更深入的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。

根据国内外研究进展，在前期已构建fimA原核表达质粒的基础上，本研究拟在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中表达FimA融合蛋白，并通过金属螯合亲和层析技术进行纯化，为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体、研发用于人类的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供实验基础。

2 文献回顾

牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病，在我国有很高的发病率[7]。牙周炎累及牙齿数目多，预后差，是造成牙齿缺失的主要原因。随着我国进入老龄化社会，牙周炎的预防将成为突出的保健问题。世界卫生组织已将牙周组织健康列为健康人的十项标准之一[7]。探索预防和治疗这种严重危害人类口腔健康的疾病的方法，对于改善我国人民的口腔健康水平，提高人们的生活质量有着重要意义。

大量的实验研究、流行病学资料和临床观察表明[7]，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引发牙周炎的始动因子，是造成牙周组织破坏的必须因素。牙周菌斑中绝大多数细菌为口腔固有菌丛，对宿主无不良影响，仅少数细菌与牙周炎的发生、发展密切相关。其中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis， Pg）是目前获得公认的一种牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势病原菌，而健康龈沟内很少[7， 8]。目前牙龈卟啉单胞菌也是牙周微生物学领域重点研究的厌氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系统性疾病的研究中，血清学、动物模型、细胞培养的研究证实[9-11] Pg感染与心脑血管疾病的发生有关，而且有学者报道[12]Pg的感染与低体重婴儿的分娩也有关。

Pg含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占据重要地位，而且与Pg在口腔的定植有关，为Pg的优势抗原之一。另外，因其具有广泛的生物学活性而成为牙龈卟啉单胞菌研究的一个热点。

菌毛（pili，fimbriae）是位于革兰氏阴性菌Pg菌体表面的一种弯曲的、单股的丝状物，长0.3～1.0 μm，直径为3.5～5.0 nm，遍布细菌表面，多者每菌可有数百根，由菌体表面伸向细胞外。其化学组分是一种蛋白质，与细菌的运动无关。

2.1 菌毛的致病机制 2.1.1 介导Pg附着于口腔

Pg附着于宿主组织表面是其定植于口腔的关键，也是其致病的先决条件。Pg可选择性的直接附着于口腔内特定部位组织的表面，或识别已经附着在组织表面的细菌，然后间接的附着于组织表面。

1）菌毛可介导Pg附着于口腔内各种组织细胞的表面

菌毛可介导Pg黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；唾液中的重要蛋白质成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG、富酪蛋白PRT）；乳铁转运蛋白，细胞外基质蛋白（ECM）（如玻连蛋白和纤维连接蛋白）。人细胞外基质蛋白通过与FimA受体配体的结合在细胞外信号转导中起重要作用。菌毛对基质蛋白有很强的亲和力，而且明显抑制玻连蛋白/纤维连接蛋白与其受体αβ3和配体α5β（在中国仓鼠卵巢CHO细胞株中过度表达）的相互结合。在牙周组织中，菌毛可能通过细胞外基质蛋白受体/配体途径阻断细胞外信号转导。

菌毛还可介导Pg黏附于牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、人口腔上皮细胞、人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，附着并凝集人或羊的红细胞等。Umemoto[13]构建了无菌毛的Pg突变株，发现其对人口腔上皮癌细胞的黏附性和侵袭性均降低，接种小鼠后引起牙槽骨丧失的量也减少。其他学者构建了不表达菌毛的Pg缺陷株，发现它们黏附和侵袭人牙龈成纤维细胞[14]、上皮细胞[15]、内皮细胞[16]和树突状细胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。这些研究结果说明菌毛在Pg黏附于口腔上皮细胞的过程中起重要作用。

此外，研究发现Pg可黏附于唾液覆盖的羟基磷灰石（hydroxyapatite coated with saliva，sHAP），这种黏附活动常被作为研究Pg与口腔内唾液覆盖的各种组织细胞黏附活动的模型。Lee[18]等的研究发现，Pg与羟基磷灰石之间的这种黏附活动需要菌毛参与，而且抗菌毛的抗体能完全抑制这种黏附作用。学者们[14， 16]通过同源重组技术灭活fimA基因后，发现突变株与sHAP的黏附能力降低。这些研究结果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆盖的口腔内各种组织表面的过程中起重要作用。

2）在菌斑形成的早期，菌毛可介导Pg黏附于附着在获得性膜表面的细菌，间接的附着于组织表面

细菌之间的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。链球菌是最先定植于牙齿表面的主要细菌，Pg通过菌毛与链球菌细胞表面的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）高亲合力、高特异性的结合而与链球菌发生共聚，这种相互作用在Pg定植于牙周袋的过程中可能起重要作用。此外菌毛还参与Pg与放线菌、福赛氏类杆菌之间的黏附过程。

3）有关黏附机制的研究

现在已经明确Pg黏附于口腔的过程为一种特异性识别过程，菌毛可能为特异性配体，与宿主细胞膜上的特异性受体相互作用[7]。部分Pg菌毛可识别的黏附受体现已明确，如βintegrins[7，19]、上皮细胞的细胞角蛋白14[20]、巨噬细胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通过上皮细胞的βintegrins促进Pg与牙龈上皮细胞的黏附，抗βintegrins的抗体能抑制Pg的黏附和侵袭[19]。Pg菌毛通过单核细胞上的TLR2、CD14和CD11a/CD18，诱导外周血单核细胞IL-6 mRNA的产生、细胞因子的分泌、p38促有丝分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬细胞的实验研究表明，β2 integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬细胞与Pg菌毛黏附的细胞受体；而且β链（CD18）在信号转导中起关键作用。

综上所述，菌毛可介导Pg黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳铁转运蛋白、细胞外基质蛋白；宿主细胞（如牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞，巨噬细胞等）；口腔内的细菌（如链球菌、放线菌、福赛氏类杆菌）。借助于菌毛黏附于这些物质，Pg可在口腔内进一步定植、侵袭、诱导炎症反应的发生。

2.1.2 引发炎症反应和免疫反应

Pg附着于口腔内组织细胞后，其抗原成分和毒性产物等可引发白细胞的趋化、吞噬等炎症过程，造成表面组织的损伤——其中Pg菌毛能与脂多糖一起激活宿主的防御机制、诱导多种炎性细胞因子的产生；此外细菌及其产物还通过上皮细胞或者细胞间质进入表层下组织，在组织内繁殖，甚至扩散至全身。

1）Pg菌毛的白细胞趋化作用

牙周炎再现了一种重要的中性粒细胞介导的破坏宿主组织细胞的模型。牙周炎的优势病原菌P生的毒力因子主要就是用于调节中性粒细胞的反应。其中Pg菌毛能诱导多种可趋化白细胞至炎症部位的细胞因子的分泌。

Pg菌毛可诱导内皮细胞表达趋化因子IL-8（Interleukin-8）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）：感染了野生型Pg的人脐静脉血管内皮细胞持续低剂量的表达IL-8和MCP-1，而Pg的fimA基因突变株则不能诱导IL-8和MCP-1产生。同时，抗菌毛的特异性抗体也能阻断上述因子的产生。这些提示IL-8和MCP-1的产生是由菌毛特异性引起的。

IL-8和MCP-1都是诱导白细胞到免疫反应部位的有效的趋化因子。MCP-1又称单核细胞趋化激活因子（monocyte chemoattractant activating factor， MCAF），它作为趋化因子超家族的一个主要成员，可以由机体多种细胞合成和分泌（如人牙龈上皮细胞），是重要的炎性细胞因子，在机体对入侵的病原微生物的炎症反应和免疫反应中，起重要调节作用。MCP-1的主要生理作用是特异性的趋化中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位聚集， 同时还有激活巨噬细胞的功能。而且炎症部位的细胞因子如IL-1、TNF-α等可以刺激机体的免疫细胞及其他细胞表达MCP-1，该过程中所产生的MCP-1能进一步特异性的趋化巨噬细胞和单核细胞向病损部位聚集。中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位聚集，是炎症反应中的一个重要过程。巨噬细胞是参与牙槽骨代谢的重要的免疫细胞，被激活的巨噬细胞能产生大量的骨吸收性细胞因子。也有学者认为巨噬细胞是破骨细胞的前体细胞，在破骨细胞分化因子的存在下，体外培养的巨噬细胞可以向破骨细胞分化。而牙槽骨的吸收是牙周病的一个重要病理特点，是病变进程、发展和愈后的一个重要指标。这些提示Pg菌毛能通过免疫细胞及其他细胞产生的MCP-1间接的趋化巨噬细胞向炎症部位聚集，增加破骨细胞的数量，促进破骨细胞的分化和成熟，进而促进牙槽骨的吸收。

Pg菌毛可诱导内皮细胞表达粘附分子ICAM-1、VCAM-1和选择素（selectin）：Pg菌毛诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞内黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）以及P-selectin/E-selectin。而且加入按照人工合成的菌毛氮末端氨基酸序列多肽能上调上述分子的表达，而Pg 的fimA基因突变株或含有抗Pg菌毛蛋白抗体的血清与人脐静脉内皮细胞共培养时，不能诱导上述分子的表达。

内皮细胞通过上述分子selectin，ICAM-1和VCAM-1可诱导和趋化血液循环中的白细胞黏附至内皮细胞。其中选择素是血管粘附分子大家族中的一大类成员，根据表达部位可分为三类[21]：表达于活化的内皮细胞表面的E-selectin；表达于白细胞表面的L-selectin；表达于活化的血小板和内皮细胞表面的P-selectin。在感染以及其他炎性反应发生过程中，selectin通过与其相应配体结合介导白细胞（中性粒细胞、T-和B-淋巴细胞以及单核细胞等）与血管壁（特别是毛细血管后静脉）接触，并使白细胞在血管壁上缓慢滚动，从而启动一系列反应，最终导致白细胞在炎性反应区域集中。ICAM-1也可促进白细胞黏附、移动和趋化至炎症部位。血液循环中的单核细胞和白细胞黏附和趋化至内皮细胞，然后穿过内皮细胞在局部聚集是炎症反应的重要过程。Pg菌毛通过诱导内皮细胞所表达的selectin、VCAM-1和ICAM-1，趋化单核细胞和白细胞至炎症反应的局部，可能在牙周病中起重要作用。

2）Pg菌毛诱导多种炎性细胞因子的产生

（1）Pg菌毛诱导外周血单核细胞产生炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化学趋化因子IL-8，诱导p38促有丝分裂蛋白激酶磷酸化，刺激单核细胞诱导的细胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p50和p65亚单位的活化（通过TLR信号转导途径），从而诱导高滴度的NF-κB依赖性细胞因子的释放。NF-κB是细胞中一个重要的转录调节因子，是Rel家族的成员，几乎存在于所有细胞中，在免疫反应、应激反应、细胞凋亡及病毒复制的调节中起主导作用，可在炎症部位高度表达，提示其在免疫反应和炎症反应中起着关键作用。受NF-κB调节的炎性细胞因子有：肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α和TNF-β）；粘附分子（ICAM-1，VCAM，E-selectin）；白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12）；集落刺激因子（CSF）（粒细胞-CSF，粒细胞和单细胞-CSF）；β-干扰素（INF-β）等。因此，NF-κB是多种促炎症基因高度转录的必须因子。同时，由NF-κB调节的产物，如TNF-α和IL-1β又能激活NF-κB，这就意味着存在一个能放大且延续炎症反应的复杂的调节环路。

（2）Pg菌毛还能通过TLR2信号途径诱导小鼠腹膜巨噬细胞产生RANTES、INF-γ、IL-17、VCAM-1、血管内皮细胞生长因子，诱导MCP-1 mRNA的强表达。CD18可能在相关的信号转导机制中起重要作用。Pg菌毛可诱导巨噬细胞样细胞株U937表达IL-1β，IL-8，IL-12和TNF-α。fimA基因正常表达的Pg菌株能诱导单核细胞来源的树突状细胞表达炎性细胞因子TNF-α、IL-6，免疫调节细胞因子IL-10和趋化因子IL-8，而fimA基因的突变菌株Pg DPG3就不能诱导上述细胞因子的表达。而且用菌毛蛋白刺激单核细胞来源的树突状细胞，能在自体混合淋巴细胞反应（MLR）和自体的CD4+ T细胞中诱导以IFN-γ为主要细胞因子的Th1-型免疫反应。

关于菌毛诱导各种炎性细胞因子的产生的机制，Hajishengallis[22]的研究表明：体内免疫系统的Toll-like receptors（TLRs）和其他模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）组成了一种功能性受体复合物，识别并对病原菌相关模式分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）起反应。在这种相互作用中，菌毛作为一种病原菌相关模式分子与宿主细胞的模式识别受体复合物相结合。CD14和CD11b/CD18是一种募集性受体，TLRs则是一种信号转导受体。TLR2和TLR4与介导菌毛活化细胞有关，其他的模式识别受体如CD14和CD11b/CD18与介导细胞对菌毛的识别有关。菌毛通过激活TLR信号转导途径，诱导单核细胞产生炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化学趋化因子IL-8，并诱导抗原呈递细胞中协同刺激性分子CD40、CD80和CD86表达的上调。此研究结果也提示菌毛对宿主免疫系统有潜在的“危害”。

3）Pg菌毛诱导多种与调节骨代谢有关的细胞因子的产生，改变牙槽骨的代谢，诱导骨的吸收

Pg菌毛所诱导产生的细胞因子如IL-1、TNF-α是骨重建中重要的局部调节因子，在牙槽骨的吸收破坏中起重要作用，可促进结缔组织基质的降解，刺激骨的吸收，与牙周炎密切相关[1]；IL-1、IL-8、TNF-α等细胞因子还可通过自分泌和旁分泌途径，刺激更多的IL-1、IL-8、TNF-α的产生，使炎症加重和扩大，引起组织的进一步破坏。提纯的菌毛蛋白还能浓度依赖性的诱导肝细胞生长因子HGF/SF的产生。HGF/SF，也名为趋化因子SF，由间充质细胞产生，主要作用于上皮细胞，与刺激破骨细胞的活化有关。

Evans[23]研究发现表达菌毛的Pg能诱导无菌鼠牙槽骨丧失，而不产生菌毛的Pg诱导无菌鼠牙槽骨丧失的能力显著降低，而且用提纯的菌毛蛋白免疫无菌鼠可预防Pg所导致的牙周组织的破坏。这也证实了菌毛与牙槽骨的吸收密切相关。

4）Pg菌毛抑制单核细胞和巨噬细胞的凋亡

单核细胞和巨噬细胞的凋亡可能与慢性炎症性疾病密切相关。在缺乏生长因子的培养液中，Pg菌毛蛋白可抑制人单核细胞THP-1的凋亡。这种抑制作用能被抗菌毛蛋白的抗体所完全抑制。菌毛可激活细胞外信号传导激酶（signal-regulated kinase，ERK），刺激细胞内依赖细胞周期的蛋白激酶抑制剂p21的表达，从而阻断单核细胞和巨噬细胞的凋亡，提示菌毛可阻断单核细胞和巨噬细胞的凋亡，是慢性炎症性疾病牙周病的一种重要的调节分子。

5）Pg菌毛诱导免疫反应

慢性牙周炎与牙龈卟啉单胞菌感染不成熟树突状细胞（dendritic cells，DCs）、诱导真皮下DCs和基底膜中成熟的DCs数量的增加有关。Jotwani[24]的研究证实fimA基因正常表达的菌株Pg381与fimA基因的突变菌株PgDPG3相比，能更高效进入单核细胞来源的树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells，MDDCs）中，诱导DCs的成熟。Pg381感染MDDCs后，能诱导高水平的自体混合淋巴细胞反应，诱导Th1-型免疫反应。用菌毛蛋白刺激MDDCs，也能诱导DCs成熟，而且成熟的MDDCs还能诱导自体同源性CD4+T细胞的增殖，γ-干扰素（gamma interferon，IFN-γ）的释放。这些结果提示Pg菌毛可能在诱导MDDCs吞噬Pg和诱导Th1-型免疫反应中起重要作用。

Amano[25]报导在牙周炎病人体内能检测到高滴度的抗菌毛的特异性IgG和IgA抗体。Condorelli[26]报导在牙周炎病人71.7%活动性位点和58.7%非活动性位点的龈沟液（gingival crevicular fluid ，GCF）中能检测到抗Pg菌毛的特异性IgA抗体，而在健康对照组的所有位点的GCF中均不能检测到抗菌毛的特异性IgA抗体。这些流行病学研究的结果表明Pg菌毛具有良好的免疫原性，能在体内诱发免疫反应。

Pg菌毛所诱导的免疫反应具有保护作用：Evans[23]等用提纯的菌毛蛋白和一种人工合成的20个氨基酸的菌毛多肽免疫无菌鼠后，鼠血清中抗菌毛的特异性抗体滴度较用全菌免疫后鼠血清中的抗体滴度高3～4倍。当给无菌鼠口腔接种Pg后，菌毛免疫鼠的牙周组织未受到破坏。Yanagita[27]以菌毛蛋白鼻腔黏膜免疫小鼠（霍乱毒素CT为免疫佐剂），能在黏膜效应组织（包括鼻腔通道，颌下腺）的CD4+T细胞诱导Th1-/Th2-型免疫反应。而且颌下腺产生的抗原特异性的IgA多克隆抗体可抑制Pg黏附于上皮细胞，减少上皮细胞细胞因子的产生。提示菌毛是一种有潜力的研制牙周炎疫苗的候选免疫原。

6）Pg菌毛诱导泡沫细胞的形成

有学者报导Pg的感染与动脉粥样硬化[28]的发生有关。动脉粥样硬化是一种由血管壁开始的慢性炎症性反应，其中泡沫细胞的形成是其重要特点。Giacona[28]研究证实人体巨噬细胞在感染野生型Pg后，形成泡沫细胞的量明显增加，但是感染fimA基因的突变菌株Pg DPG3后没有明显的变化，提示菌毛是Pg诱导泡沫细胞形成的必须因素，Pg菌毛可能与动脉粥样硬化的发生有关。

2.2 有关fimA基因表达调控的研究进展

Pg fimA基因的表达途径有以下三种[29]（按照表达和装配系统分类）：陪伴/引导分子途径系统、第二分泌系统、核化依赖聚合系统。fimA基因表达的初始产物具有非常长的前序列。Pg蛋白酶参与fimA基因的翻译后处理、转运和装配[29]。fimA基因的表达还受到以下因素的影响。

1）局部理化环境对Pg fimA基因表达的影响

研究表明[30]，Pg fimA基因的表达及菌毛依赖性表型的活性均受到温度、离子浓度等环境条件的影响。

龈下区的温度并不恒定，常随牙齿部位及炎症程度而变[31]，健康龈下区温度一般在34℃～37℃，而炎性牙周袋内温度　可达39℃。Xie等[32]通过fimA启动子-lacZ受体基因融合研究环境因素对Pg fimA基因表达的影响时，发现当龈下区温度由34℃升至39℃时，Pg fimA基因表达可减少至1/10。Murakami等[33， 34]的研究同样证实温度升高时，基因fimA的表达水平降低。Amano等[35]报导温度从37℃提高到39℃时，Pg对唾液成分和链球菌的黏附能力降低，Pg在牙周炎病人的血清中的抗原性发生改变。温度影响DNA的超螺旋结构，改变组蛋白与DNA结合的活性[36]，从而降低基因转录的速度[37]。Pg根据温度的变化来调整fimA基因表达的水平，可能是在机体感染Pg早期，fimA基因表达水平较高，有利于Pg黏附及侵入牙周组织；随着炎症程度加重、牙周袋形成和局部温度升高，菌毛的产生受到遏制，从而使菌毛的某些功能特性发生改变，而有利于Pg的生存。

基因fimA的表达还在转录水平受氯化高铁血红素浓度的调节[38]。铁在Pg的生长繁殖和毒力中起关键作用，Pg以血红素的形式吸收铁[39]。McKee[40]等发现，Pg在氯化高铁血红素过量时，毒力增强。在氯化高铁血红素不足时，Pg生长速度降低，Pg菌体表面菌毛数量减少[40]，血凝素基因hagB和hagC的mRNA表达水平降低[41]，但是，致病因子如溶血素和胰蛋白酶样蛋白酶等的数量及其致病毒力均明显增加[42， 43]。为进一步阐明氯化高铁血红素在调节fimA基因表达中的作用，Xie等[38]研究了fimA基因的转录活性，结果显示在缺乏氯化高铁血红素的情况下，fimA启动子活性降低50%，表明氯化高铁血红素可以对Pg fimA基因表达起正调控作用。但是这种调控作用不如温度变化对其影响的程度明显。虽然在氯化高铁血红素缺乏时，Pg的生长速度降低，但此时fimA启动子活性降低与Pg生长速度的降低并没有直接的联系[38]，fimA启动子的活性并不依赖于Pg的生长阶段。氯化高铁血红素调节Pg fimA基因表达的具体分子机制仍不清楚，许多受离子调控的基因在其启动子区均存在“离子盒”，而在fimA启动子区并没有与此具有同源性的区域结构[44]。推测可能是由于Pg多种致病因子基因的表达共同受到氯化高铁血红素的调节所致。

影响Pg fimA基因表达的局部理化环境还包括血清、唾液、渗透压、Ca2+浓度以及pH值等。

关于Pg如何感受到环境的变化，并把这种信息传递给细胞的机理并不完全清楚。但是研究发现信号转导系统的两种成分FimS-FimR与Pg fimA基因的表达有关[45]。FimS是一种组氨酸蛋白激酶基因的等位基因，FimR是反应调节基因的等位基因[45]。FimS 和FimR的分裂会导致菌毛形成量的明显降低。fimA基因的表达可能受到FimR反应调节器的正调控[46]。FimR调控包括fimA基因位点周围的5个成串的基因——fimA cluster在内的多个基因的表达。染色体免疫沉淀反应和电泳分析表明，菌毛蛋白黏附到fimA cluster中的第一个基因的启动子区域。突变菌株的基因表达分析表明，fimA基因转录过程包括多个步骤，FimR基因上调fimA cluster中的第一个基因的表达，而此基因编码一个在fimA基因的表达中起关键作用的调控蛋白。

2）其他口腔微生物对Pg fimA基因表达的调控

牙菌斑是一种附着了各种细菌的生物膜，这些菌斑微生物之间可以通过细胞间信号转导机制互相影响。Pg通过与获得性薄膜中的唾液分子[25]或者先前定殖的细菌如口腔链球菌[1]相接触而定殖于牙菌斑生物膜中，然后与牙菌斑生物膜中的其他微生物共生。但是，Pg不能聚集于链球菌突变株或者S.cristatus这一底层的上面[47]。针对这一现象的进一步研究揭示链球菌S.cristatus CC5A能明显降低Pg的fimA基因的表达水平，其浓度与fimA基因表达水平呈负相关，浓度升高时甚至可使fimA启动子活性下降1/2[48]。但是，在实验中尚未发现菌斑中的其他细菌，如纤细链球菌G9B和M5、血链球菌10556、变形链球菌KPSK2、内氏放线菌NC-3、齿垢密螺旋体GM-1以及具核梭杆菌10953等对fimA基因的表达具有这种调控作用[49]。

目前的研究结果认为，S.cristatus CC5A与Pg之间的这种信号转导开始于Pg受体对CC5A信号的识别[47]。信号分子是链球菌S.cristatus细胞膜表面的一种分子量为59kDa的CC5A蛋白，与其他革兰氏阳性菌分泌的短信号肽有明显区别[49]。菌毛自身并非受体，fimA基因突变的Pg株与CC5A蛋白的结合与野生型Pg菌株与CC5A蛋白的结合没有区别。这些结果表明，早期共生菌斑和后期致病性菌斑中的许多细菌并不影响fimA启动子转录的活性，不影响Pg菌毛的产生，因而能够与Pg相互共存。但是，S.cristatus CC5A能特异性地使Pg fimA表达水平降低，从而影响菌毛的产生，阻止Pg在菌斑内的进一步的繁殖。

3）Pg自身产物对fimA基因表达的调控

目前，定点诱变试验表明[50]，在fimA基因上游区域存在一个σ70-识别的RNA聚合酶结合位点，研究证明，调节蛋白能够与此位点特异性的结合，从而影响RNA聚合酶的功能。Xie等[48]发现有三种蛋白可结合于fimA基因，分别是菌毛蛋白、赖氨酸蛋白酶（Kgp）以及精氨酸蛋白酶（Rgp）的翻译后处理片段。

将外源fimA启动子-LacZ受体插入携带fimA突变基因的Pg菌株内，结果发现插入的外源性fimA启动子不能活化，fimA mRNA表达水平低；但若仅使fimA结构基因上游区域产生突变，则不影响启动子的活性，fimA mRNA的表达水平与野生型菌株相同[48]。提示fimA基因在表达过程中，表达产物可作为调节蛋白与自身启动子上游区的RNA聚合酶结合位点结合，从而正反馈性调节Pg fimA基因的表达。

Pg的半胱氨酸蛋白酶（Rgp和Kgp）也参与调节fimA基因的表达。有研究[51]报道当rgp表达水平较低时，Pg表面菌毛数量减少。rgpA和kgp基因失活的Pg菌株YPP1和YPP2与野生型Pg相比，fimA mRNA表达水平明显降低[52]。Pg 381的rgp A基因突变的变异株不表达菌毛，rgpB基因变异菌株表达的菌毛水平较野生型菌株低[48]。Tokuda[53]等也证明rgpA单基因突变菌株的fimA mRNA表达水平下降，表达的菌毛蛋白很少，通过Western印迹分析不能检出菌毛蛋白，其表面的菌毛通过电镜也无法观测到。菌株Pg 33277 的rgpA和rgpB双基因缺陷变异菌株则不表达菌毛[48]。这些研究结果均证明蛋白酶可在转录水平直接影响菌毛蛋白的产生。此外，在菌毛蛋白翻译后修饰加工的过程中，Pg蛋白酶还参与到对菌毛蛋白N-末端氨基酸的修饰加工。

这些资料均表明包括菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶在内的几种Pg来源的蛋白都是fimA基因表达调控系统的组成部分，它们能够与fimA基因的上游区域结合，从而影响fimA基因的mRNA表达水平。

综上所述，影响Pg fimA基因表达的因素有：局部理化环境，包括温度、氯化高铁血红素的浓度、血清、唾液、渗透压、Ca2+浓度以及pH值等；牙菌斑中的细菌如S.cristatus CC5A；Pg自身产物，如菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶等。如能对fimA基因的表达过程详细研究，在fimA基因转录的过程中加以某种干预，使Pg菌毛蛋白的转录、翻译水平降低，或者使fimA基因翻译后的修饰加工过程受到干扰，使菌毛所介导的Pg的黏附、侵入降低，病理性作用减少，就有可能降低Pg相关性牙周炎的发病率和严重性，这也是未来的一个研究方向。

2.3 有关fimA基因分子克隆的研究进展

Dickinson等[54]1988年首次克隆并测序了Pg381 fimA基因。Fujiwara等[55]1993年克隆并测序了9种Pg菌株的fimA基因，结果揭示这9种Pg菌株的fimA基因覆盖1044～1083 bp，所编码的多肽分子量为37，527～38，239，菌株之间有一部分相同的序列，同时具有大量的不同序列。Fujiwara[55]首次按照fimA基因核苷酸序列的不同，将Pg分为4种基因型。

Sharma等[56]1993年首次用表达载体pET-lld，大肠杆菌BL21表达了Pg 2561的部分菌毛多肽（氨基酸10～337）。Washington等[57]1993年用表达载体pET-lld，大肠杆菌BL21表达了Pg 381 fimA的一部分片段（1 kb）（fimA基因全长为1044bp）。

Sharma等[58]1996年首次构建了表达部分菌毛多肽的重组链球菌——一种活载体疫苗。以pUC13Bg12.1为模板，将编码Pg 2561 FimA蛋白部分肽段（N-末端55～145[90个aa]和C-末端233～322残基[89个aa]）的基因，PCR扩增后，定向插入到链球菌（Streptococcus gordonii）M6基因（emm6.1）的Kpn I-Hind III位点，获得融合表达质粒pSMB55，然后转染于口腔链球菌（S. gordonii GP251）中，制备为一种以细菌为载体的基因工程减毒活疫苗。在链球菌M6蛋白（氨基酸1～122和302～441）的锚定区，表达菌毛多肽（氨基酸55～145和233～322），形成一种融合蛋白。此链球菌所表达的菌毛多肽可竞争性的抑制Pg结合于唾液覆盖的羟基磷灰石上。而且将此疫苗菌株口腔内免疫无菌鼠后，可诱导血清异性IgA、IgG抗体和唾液异性IgA抗体的产生，并能防止Pg所导致的牙槽骨的吸收[59]。Sharma等[60]1999年进一步在链球菌Streptococcus gordonii表面，表达FimA蛋白的C-末端多肽（226～246），但是实验证实这种包含游离半胱氨酸残基的多肽在链球菌的表面表达很弱。

Kawabata等[61]1999年以克隆质粒pSM36为模板克隆了fimA基因，以真核表达质粒pcDNA3首次构建了fimA核酸疫苗pcDNA3/fimA。体外转染NIH3T3真核细胞后，可检测到菌毛蛋白的表达，说明了在真核细胞中表达FimA蛋白的可行性。定向唾液腺（TSG）免疫BALB/c小鼠后，成功的诱导了体液免疫和细胞免疫，在唾液和血清中能检测到特异性抗体。免疫后的小鼠，血清中抗FimA特异性IgG抗体主要的亚类是IgG2a，唾液腺单核细胞Th2-型细胞因子特异性mRNA增加，脾中产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。

Shin等[62]2005年首次报道在植物中表达菌毛多肽。Shin等[62]克隆FimA蛋白的C-末端氨基酸残基266～337的编码基因，然后插入到植物的表达载体中编码CTB（霍乱毒素B亚单位）的基因片段的下游，然后此嵌合性载体ctb-fimA被转染到马铃薯（Solanum tuberosum）细胞中表达蛋白。通过ELISA对CTB-FimA融合蛋白的定量分析表明，此蛋白占全部可溶性蛋白的0.33%，表达量较低，尚需要进一步改进。

国内刘鲁川[63]1994年首先以pUC13Bg12.1质粒为模板，PCR扩增fimA基因部分片段（504～1045 bp，总扩增长度为542 bp）。

郭红梅[64]2007年成功的构建了FimA蛋白与IL-15真核共表达质粒，以其作为DNA疫苗经滴鼻免疫Wistar大鼠，能够激发　机体产生特异性的系统免疫应答，又能激发粘膜免疫应答。疫苗所表达的IL-15可以作为辅助因子增强sIgA应答，对Pg引起的实验性牙周炎提供有效的保护，为解决增强sIgA应答来对牙周组织提供保护的难题提供思路。

2.4 有关大肠杆菌表达系统

2.4.1 大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统[65] 。大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解，而且有大量可供选择的克隆载体与表达载体，已经成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统[66，71]。大肠杆菌遗传图谱明确，容易培养且费用低，对许多蛋白质有很强的耐受能力，能高水平的表达这些蛋白质。但是，在实际工作中，常常需要使外源基因得到最佳的表达，以满足人们各种研究需要。此外，许多外源基因在大肠杆菌胞内表达时，往往不能自发折叠卷曲生成有一定空间结构的特定功能的蛋白质，而是以一种不溶性的沉淀即包涵体的形式存在于细胞内[67 ，68 ] 。包涵体的形成在某种程度上限制了大肠杆菌表达系统的应用。由于处于包涵体中的重组蛋白没有生物活性，为使重组蛋白具有生物活性，必须将包涵体复性，而包涵体的变性、复性一直困扰着许多科学工作者[69，70] 。

2.4.2 在大肠杆菌中表达外源蛋白的优化[71]

1）翻译效率的优化：启动

有效启动翻译需要起始密码上游的核糖体结合位点。翻译起始过程中，5～9个核苷酸长的Shine-Dalgarno序列与16S RNA的3'末端发生作用。Shine-Dalgarno序列与起始密码ATG之间的距离对翻译效率有影响，在ATG下游插入开放阅读框架的载体，此段距离已经优化，如果克隆基因以自身的ATG起始翻译，起始密码应位于Shine-Dalgarno序列下游5～7个核苷酸。

翻译起始区的二级结构也影响基因表达效率。Chen等通过改变Shine-Dalgarno序列上、下游的核苷酸，减少二级结构的形成，提高了基因表达水平。与此类似，也有一些基因通过共翻译，也就是在一段翻译序列的下游插入目的基因编码序列，提高了表达水平。

2）密码子的使用

遗传密码与氨基酸并不是一对一的关系，61种密码子编码20种氨基酸，而其中只有两种是由单一密码子编码的，其余的18种中的每一种都有多个密码子，编码同一种氨基酸的不同密码子的使用频率也是不同的。

如果编码区中有大量的或成串儿的稀有密码子，通过突变或基因重合成去除这些稀有密码子，可以提高表达水平。另外，如果靶序列中有稀有密码子AGA或AGG，会带来一些特殊问题，因为它们在编码区内部又形成额外的Shine-Dalgarno序列。

编码外源蛋白氨基酸的序列对表达水平也有很大影响。因此有必要用聚合酶链反应（PCR）或定点突变的方法，把表达基因N端的7～8个密码子变成大肠杆菌中最常用的密码子。还应尽可能通过这些方法将靶基因5'端（G+C）含量降至40％以下。

3）培养条件优化

在表达系统相同的情况下，不同的培养基常导致表达水平的巨大差异。LB类标准培养基可以用于建立表达的基本参数，但只有对培养条件进行优化后，才能获得最佳表达，包括使用基本盐培养基，如M9，限定盐培养基，如诱导培养基，或丰富培养基，如肉汤、YT或NZCYM。

一些培养基添加剂能提高某一种特定蛋白的表达水平。这其中包括浓度在0.1～0.5 mol/L之间的NaCl、不可代谢糖如蔗糖（0.2～0.6 mol/L）、辅助因子（血红素）和抗生素。Lee和Beckwith注意到，分泌途径缺陷的抑制基因位于与蛋白质合成有关的基因上，这些抑制突变的最终效果是降低蛋白合成速率，而低浓度抗生素能在大肠杆菌中模拟它的作用。表达外源蛋白尤其是分泌蛋白时，在培养基中加入抗生素，如氯霉素（1 μg/ml）和四环素（0.1 μg/ml），能降低蛋白合成速率，防止分泌系统过载，分泌蛋白也就更容易与伴侣分子等结合，折叠成天然构象。最后，培养基的pH也能影响外源蛋白的表达，当LB培养基的pH降至5.5以下时，可溶性的α-葡萄糖苷酶的表达量显著提高。极端pH可能会使细胞生长速率降低，从而防止细菌表达/加工系统过载。

在克隆基因的上游插入强的可调节启动子和有效的核糖体结合位点，可以在细菌中表达非融合蛋白。融合蛋白能大量制备，易于纯化，而且能赋予蛋白新的免疫学或生物学分析反应特性。

2.5 六聚组氨酸融合蛋白的纯化

近年来，随着蛋白质组学研究的发展，基因工程重组蛋白的分离纯化技术显得尤为重要，要将目标蛋白从复杂样品中快速、特异地纯化出来，就需要选择合适的蛋白纯化方法。

融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便，并很快得到了应用。目前常用的蛋白纯化标签是GST（谷胱甘肽巯基转移酶），6×His（六聚组氨酸）和表位标签（如FLAG是专为蛋白纯化和检测设计的八肽，HA是流感病毒血凝素表位等），其中6×His最为常用，带有6×His标签的融合蛋白可利用固定化金属鳌合亲和层析和免疫亲和法进行纯化。

Porath于1975年首次提出固定化金属螯合亲和层析(IMAC)的概念[72]，该法基于蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基与固定化金属离子的相互作用而对蛋白质进行分离纯化。其中，组氨酸是与金属离子作用较强的氨基酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在IMAC中有效保留，故人为设计的多聚组氨酸便成为最常用的蛋白质纯化标签[73]。

免疫亲和纯化是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的技术，它具有高效、高收率、浓缩效应等优点。在众多蛋白质纯化技术中，免疫亲和纯化是十分关键的技术。标签融合蛋白可通过抗标签的单克隆抗体和多克隆抗体来纯化。多数免疫亲和纯化都使用单克隆抗体，但有两种类型的多克隆抗体可用于免疫亲和纯化，即针对合成肽(如6×His、FLAG标签等)或某种抗原的特定区域产生的抗体。在这两种情况下，由于结合到固定化抗体上的抗原位点局限在一个很小的区域，因此可实现有效的洗脱。目前已有商品化的特异性针对标签的单克隆抗体，但价格都比较昂贵。

重组蛋白在大肠杆菌（E. coli）高效表达时，往往以不溶的、无活性的蛋白聚集体，即包涵体(inclusion body)的形式存在于细胞内。必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂（如7.0 mol/L盐酸胍、8.0 mol/L脲）溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。

2.5.1 融合标签技术

1）融合标签技术

融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3'端或5'端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质[74-78]，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。近几年，随着新的融合标签系统的开发，其功能逐渐多样化，除用于蛋白质纯化外，还用于蛋白质定位和检测等。

2）融合标签的种类

融合标签根据其分子量大小可分为两大类:大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段。大的蛋白质标签有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)、SPA(葡萄球菌蛋白A)和GFP(绿色荧光蛋白)等，它的使用会增加目标蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。小的多肽标签有6×His(六聚组氨酸)、HA(流感病毒血凝素表位)、c-myc(人c-myc蛋白表位)、FLAG(专为蛋白纯化和检测设计的八肽)等，多数情况下，由于多肽标签相对较小，对融合蛋白质结构影响小，不需要从融合蛋白质中切除，因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。迄今为止，己有文献较为详尽地报道了各种融合标签[79，80]，其大小从几个氨基酸到蛋白质不等，相互作用类型包括酶与底物、细菌受体与血清蛋白、六聚组氨酸与金属离子、抗原与抗体等[81]。

3）融合标签技术用于蛋白的纯化

融合标签技术用于重组蛋白质纯化已为大量实验所证实[82-86]。理论上，根据亲和纯化原理可定向设计使目标蛋白质与纯化基质之间不发生任何直接相互作用的融合标签，以避免由于这种直接相互作用造成蛋白质变性。目前已有许多不同的标签可供利用。它们利用了标签与固相配体间的相互作用，从而可从复杂的提取物中对标签融合蛋白进行选择性的结合和洗脱。目前常用的蛋白纯化标签是GST，His和表位标签。

最常用的标签是His标签，即多聚组氨酸。该标签由6～10个连续组氨酸组成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His标签与其他标签相比有很多明显优势：①对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力[87]；②与金属离子的结合不受变性剂(尿素、胍)的影响；③温和多样的洗脱条件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各种商品化介质(Ni-NTA-Agarose，Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His标签的单抗或多抗也被应用于His融合蛋白的纯化。

GST标签是用来从细菌表达系统中纯化蛋白较为成功的标签之一。在该系统中，GST与被标记的蛋白进行融合，融合后的蛋白可在许多表达系统中表达。GST和谷胱甘肽紧密结合，融合蛋白可通过谷胱甘肽固相柱纯化，洗脱未结合的蛋白后，结合蛋白可用含游离的谷胱甘肽缓冲液进行洗脱。该系统中被融合的目标蛋白常可正确的折叠成为有功能的区域，故十分有用。该系统的另一个优势是可快速、温和地纯化，且配体谷胱甘肽的成本较低。

表位标签(HA、c－myc和FLAG等)也已广泛用于融合蛋白的纯化研究。目前已有商品化针对表位标签的单克隆抗体。为使标签在纯化中发挥良好的作用，在纯化过程中应尽量避免使用剧烈的条件使抗体和标签之间解离，剧烈的条件可使抗原发生不可逆变性，目标蛋白的回收率低。用游离多肽竞争洗脱法洗脱结合在固相抗体上的标签融合蛋白，是优选的方法。

4）融合标签技术在其他领域的应用

融合标签可提高重组蛋白的产量，由于外源蛋白质对于宿主菌的异质性，当外源蛋白质在宿主菌内表达时，宿主菌会调动各种机制来阻止外源蛋白质过量表达，导致的直接后果就是我们所需要的目标蛋白质表达量降低。近几年的研究发现，当外源蛋白质融合某些特定的标签后，能够有效增加重组蛋白质的产量[88-90]。

融合标签还可增强重组蛋白质的可溶性，外源蛋白质在宿主菌内表达时大多以包涵体形式存在[91]，致使很难获得大量有活性的天然蛋白质。为了防止包涵体形成，一般可以采用低温诱导表达蛋白质，但这种方法并非对所有蛋白质都有效。研究发现，一些高度可溶的蛋白质在与其他蛋白质融合后会促进融合蛋白质以可溶形式表达，如MBP等[92，93]。

2.5.2 金属螯合亲和层析技术

1）金属螯合亲和层析技术的发展

1948年，Hearon发现水溶液中组氨酸和半胱氨酸可与Cu2+，Zn2+形成稳定的复合物。研究还发现，固定在凝胶上的金属离子Cu2+或Zn2+可与蛋白质表面裸露有咪唑基或巯基的氨基酸残基结合。因此，含有金属离子Cu2+或Zn2+的凝胶可用来选择性吸附表面含有组氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白质。

1961年，Hellferich提出以固定于载体的金属离子来分离小分子的概念，称为配基交换层析(ligand exchange chromatography，LEC)[94，95]。

1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)”的概念[72]，首次成功地在琼脂糖凝胶上偶联了螯合配基亚氨基二乙酸(IDA)。IDA与金属离子如Cu2+螯合后，可与蛋白质结合，不同组成的蛋白质与金属离子结合力不同，据此将蛋白质进行分离。最常用的金属离子包括Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡态金属离子。不同蛋白质分子内的组氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等残基种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。

1987年，Hochuli等[96]在目标蛋白质末端接上六聚组氨酸多肽得到纯化的重组蛋白质。此后六个组氨酸标签广泛应用于重组蛋白质的纯化。近年来，原核生物表达的重组蛋白质已有50%以上都是通过末端接有六聚组氨酸多肽而被纯化出来[97]。

目前，固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。

2）金属螯合亲和层析作用原理

固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。金属螯合亲和介质与蛋白质的作用如图2.1所示。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子(如组氨酸残基的N原子、半胱氨酸残基的S原子)将取代与金属离子结合的水分子或阴离子，与金属离子形成复合物，从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基，以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应，由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化[98]。

图2.1 金属螯合亲和介质与蛋白质的作用

生物分子与金属离子间的结合强度与它们的轨道重叠程度有关，结合作用可分为三种[99-100]：

（1）静电吸引：修饰后的基质带有净负电荷，它可吸附分离表面氨基酸残基带正电荷的蛋白质。

（2）配位键结合：蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等残基上有咪唑基、吲哚基、巯基等，其氮原子、硫原子上未共用电子对与固定化金属离子形成配位键。

（3）共价键结合：固定化金属离子与蛋白质表面含硫基团作用形成共价键。

蛋白质与金属离子亲和力不同可用Pearson的软硬酸碱理论来解释[101]。该理论认为两个原子相互作用成键时，其中一个原子作为路易斯酸，另一个作为路易斯碱。根据软硬酸碱理论，金属离子如K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+属于硬酸；单价金属离子如Ag+、Cu+归类为软酸；过渡态金属离子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+属于中间酸。相应的，与金属离子结合的配基如氨基酸或蛋白质可分为三类碱，其中含氧原子(如羧基)、脂肪族的氮原子(如天冬氨酸和谷氨酸)和磷原子(如磷酸化的氨基酸)的配基属于硬碱；含硫原子(如半胱氨酸)的配基属于软碱；含芳香族氮原子(如组氨酸、色氨酸)的配基属于中间碱。中间酸Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+可与含芳香族氮原子(如组氨酸、色氨酸)的中间碱以及半胱氨酸结合。由于蛋白质表面裸露氨基酸中半胱氨酸极少，因此组氨酸残基是与过渡态金属离子结合的主要基团[102]。

六聚组氨酸融合蛋白在金属螯合亲和层析介质表面结合和解离流程如下：

（1）将螯合配基以共价结合的方式固定在固相载体上。

（2）加入含有金属离子如Co2+、Ni2+的溶液，金属离子会与螯合配基形成配位键而固定在固相载体上。

（3）加入含有六聚组氨酸融合蛋白的溶液或发酵液，使六聚组氨酸融合蛋白与金属离子间以配位键方式结合在固相载体上，而与金属离子没有作用力的蛋白被分离出去。

（4）洗脱结合在固相载体上的六聚组氨酸融合蛋白。对金属螯合亲和层析介质上所结合的六聚组氨酸融合蛋白常用pH值(pH 4～5)或含咪唑的溶液进行洗脱，低pH可减弱蛋白和金属离子的相互作用，使六聚组氨酸融合蛋白得以洗脱，而咪唑是竞争性取代剂，可置换结合在介质上的六聚组氨酸融合蛋白，较低的pH和咪唑互相配合可更好地使六聚组氨酸融合蛋白被洗脱[103]。

3）金属离子的选择

金属离子的配位数直接影响其与螯合配基及生物分子的结合，配位数既要保证能与螯合配基形成稳定的化合物，又要保证有剩余的位点与目标蛋白的氨基酸残基结合。由于金属离子所带电荷、离子半径等不同，对蛋白质呈现不同亲和力，目前常用金属离子有Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等，它们具有相同电荷，离子半径分别为69、72、74和74pm。半径越小，配位作用越强，与蛋白质形成的络合物越稳定。因此，Cu2+对蛋白质结合力最强，Ni2+次之，Co2+和Zn2+结合相对较弱[104]。

4）金属螯合亲和层析用于生物分离纯化

篇（4）

作为上海世博会赞助商,上海和黄白猫有限公司(以下简称和黄白猫)将为世博会提供超过100种专业清洁产品和工具。在世博各场馆、厕所、员工餐厅、社会餐厅、厨房,乃至世博局等公共区域都将使用和黄白猫的专业清洁用品和服务。

和黄白猫是由和记黄埔有限公司控股子公司与上海白猫(集团)有限公司于2006年3月共同组建的中外合资企业。公司前身可追溯到1948年成立的上海永新化学工业股份有限公司。该公司创立的“白猫”品牌,自1963年起已有近半个世纪的辉煌历史,在中国深入千家万户。

白猫清洁世博

记者在采访中了解到,和黄白猫在世博会项目赞助商名单上脱颖而出,完全体现了优势互补与互惠互利。

从2008年上半年和黄白猫就开始和世博局进行赞助事宜接触,应该算是日化行业里比较早的一家。

上海世博会“城市,让生活更美好”的主题与和黄白猫的品牌宗旨和核心价值――“干净到家了”完全吻合,这也成为了合作双方谈判与合作的基础。

和黄白猫董事长杜志强在接受《小康•财智》记者采访时说,“白猫”作为中国本土著名品牌、中华老字号,在全国特别是华东及上海可谓家喻户晓。“更重要的是,和黄白猫拥有民用清洁产品和专业清洁产品两个事业部,可以配套为世博会提供完整的产品与相关服务。这也是我们能服务世博会的最大优势。”

杜志强称,世博会期间预计有超过7000万人次的参观者,这一数字是2005年日本爱知世博会的近3倍、2008年北京奥运会的10倍。如此大的人流量对世博园区的公共卫生安全工作是一个极大的挑战,其中,世博各场馆、厕所、厨房等公共区域的清洁消毒卫生工作尤为重要。

他介绍,为了配合世博会对于公共区域卫生安全的要求,和黄白猫的专业用品事业部专门设计与开发了一系列清洁产品、清洁工具以及与之配套的培训、服务系统。

世博衍生价值无限

作为上海世博会赞助商,和黄白猫为上海世博会提供现金以及产品与服务的赞助。

杜志强称,受赞助协议保密条款的限制,不便透露现金以及产品与服务的具体价值。“不过,我们更看重产品与服务这块,因为它将直接服务于上海世博园区和参观者。与现金赞助相比,它的衍生价值是无限的。”

篇（5）

我伤心地趴在地上，嚎啕大哭。周围的人们却用奇怪的眼神看着我，然后鄙视地说：“这么小就发春了……”我听不懂意思，然后无奈地磨爪子，摸摸自己可爱的小绒毛和小肉垫，然后发誓今天晚上我很伤心，决心只吃一条鱼。我听见过其他野猫叫的声音，还问过一只老猫，她喵呜喵呜地告诉我，野猫半夜猫叫一般都在发春，我眨眨眼睛问她什么是发春。她摇摇头深沉地告诉我，小孩子懂这么多要干么。然后很善良地还教我发出喵呜喵呜拉长的声音，她说这个猫叫声听起来比较妩媚，以后我择偶的时候，提供给我选择的公猫会比较多。我感激地让她摸了摸我的粉红小肉垫。

晚上我真的只吃了一条鱼。从垃圾桶捡来的，味道很恶心。可是那只老猫告诉我，猫都喜欢鱼的。我是猫，当然喜欢鱼，于是我咽了下去。我做了个梦，梦到有一只善良的母猫还有一只猥琐的不明生物。不明生物对母猫不知说了什么，母猫惊叫不要。她满脸是泪，我见尤怜。我同情心泛滥，却不知道怎么安慰母猫。

然后一觉醒来我发现我换了新地方。不是那个舒服的纸皮堆，而是干干净净的毛毯。我一滚，毛毯就变色了。变得黑黑的脏脏的，上面还有我的爪子印。我默哀着毛毯，一边打量自己所在的地方。是屋子，有家具，有吃的。打量完毕。

另一间屋子的门突然开了，嘎吱的声音让我觉得很悦耳。然后我抬头以45°明媚而忧伤的姿势仰望。是一个人类。有头发有眼睛，还有嘴巴鼻子和耳朵。然后是雄性。

雄性人类似乎惊讶于我的苏醒，然后不管不顾地扑上来呼唤我羞羞……我震惊而愤怒，我做为一个雌性猫咪，绝对不能让一个雄性人类破坏了我的和清白！我爪子抓过去，然后愤怒地要撕咬。结果雄性人类却猥琐地摸了摸我引以为傲的粉色小肉垫傻乎乎地笑了。

这件事情过去一年多了，我也不再是年幼无知的小野猫了。我成了这位雄性人类口中的宠物，名字叫做羞羞。据说我是他口中从天而降的莫名其妙的宝贝。他让我唤他主人，我扭捏地给他一爪子。因为他不仅是个猥琐的变态，还好面子，勒令我不准在他房间撒尿。

现在我是一只小家猫，我有名字，我叫羞羞。

二

老大！怎么办啊！袅袅跟着那个人类住在一起了！一只哭泣的水獭以明媚而忧伤45°仰望高高在上，实际比自己矮的一只狐狸。

，我们不会去抢回来啊！王上只规定我们把袅袅带回来，其他的什么都没规定，怕什么。天塌下来，有例如我这样高的狐狸顶着。

水獭的内心泪水在汹涌。明明我一直比你高的……

二人组制订了完美的计划。名字很好很动听，叫做袅袅的浪子回归路。

请原谅这两只动物的用词不当，毕竟这是这两只动物商量一晚上否决一晚上得出的理论。

第一步。袅袅出现了，好白好亮的皮毛啊！狐狸羡慕地望向那只白色的猫，然后变身狐狸犬的他被旁边伪装成老鼠的树獭揪着办正事。老大老大，那个雄性人类要上班了，袅袅现在一个人在家，我们去抢吧！

狐狸淡定了，高傲地对书獭说。你进攻，我帮你四处看着。树獭内心更有泪水奔腾。不带这么欺负树獭的啊。树獭不情不愿地颤抖着走到猫的面前。你好……嗨……

白猫无视了这只奇怪的老鼠，思索着今天好像没有摸自己的小肉垫。

树獭的胆子大了起来，然后慢慢捂住白猫的眼睛，大叫着。狐狸老大快来帮忙啊！

白猫一爪推开这只找死的老鼠，继续思索这个伟大的问题。

引诱袅袅的回归路。宣告毁灭。

第二步。很好，袅袅又出现了。

树獭举着一条自己很舍不得的鱼隆重做了告别仪式，狐狸又气又急，然后在一旁安慰自己他笨他脑子有问题……树獭举着这条鱼，从阳台上悄悄进入白猫所在的屋子。安稳入睡的白猫翻了个身，继续睡。树獭坚持不懈地把鱼高举于白猫的眼前。

白猫翻了个身，还是睡。其实无论怎么翻，她仍然是趴着的。

内心激浪的树獭仰天泪流。狐狸老大，袅袅的浪子回归路，任重道远啊……

第三步。决心自己出手的狐狸相信自己一定能使袅袅重新回到他们身边的。他趁着袅袅在大街上闲逛的时候，拦住了她。然后飞扑着流泪……袅袅，我是狐狸叔叔啊……

白猫羞羞觉得自己今天遇到了两只神经病。狐狸哭诉着自己这几年过得不好，王上虐待，没有袅袅在身边寂寞难耐……羞羞无语地望天。 狐狸终于说出了一句正常严肃的话。羞羞，跟我走，大家都找?煤镁昧恕

茫然的羞羞抖了抖耳朵。狐狸严肃地对着茫然的白猫教育道。你是王上的三姑妈的六阿姨的四妹妹生的女儿，由于王上的三姑妈的六阿姨的四妹妹生你时跑出了生命森林，最后把你生在了人类世界，却和你失散了……袅袅，你妈妈很想你。

白猫羞羞石化了。没想到自己还有个妈妈？！而且自己根本不是人类世界的普通猫？！太惊悚了，比和雄性人类看所谓鬼片还惊悚！ 无法接受现实的白猫羞羞可耻地晕过去了……

三

白猫羞羞知道这次醒来一定在不同的地方。

是洞穴。

一只善良的白猫泪奔着朝自己飞扑而来。不用说，这是梦中的善良白猫，也是狐狸口中的妈妈了。被妈妈紧抱着的羞羞感到一种从未有过的幸福。很满足，比吃了雄性人类给自己的猫饲料还满足。

洞穴外渐渐有个黑点朝着自己走来。羞羞抬起头，却看到一匹纯白的似马非马的物种。善良白猫热情地介绍物种。这是马猫，是王上，至于辈分……怎么也想不出怎么让袅袅称呼马猫的猫妈纠结着。

羞羞看着马猫，眨巴着猫眼善良地问了一句。难道你真是马和猫生出来的？羞涩的马猫不好意思地承认了。

被雷得风中凌乱的羞羞仰天无语。

生命森林的动物很奇特。生命森林的动物很人类化。生命森林的动物很好相处。

善良的猫妈，猥琐的狐狸和树獭，以及奇怪物种马猫。从这一天起，羞羞正式改名为袅袅。

袅袅却时常很忧伤，她想起雄性人类的家，想起那群人类世界的野猫，想起雄性人类的温柔，想起他的忍让。袅袅叹了口气。难道自己还不知足么？

善解人意的猫妈让袅袅最后一次回去人类世界。袅袅回到了她和雄性人类住的屋子。很干净，地上还残留着她的猫毛。可是这个时候，雄性人类不是下班了么？她看到桌上有一叠纸，写着鸟语，不懂。却看到有照片，照片上骄傲的白猫不屑地望着镜头。

袅袅的眼角有透明液体。她自我安慰：猫是不轻易流泪的。

雄性人类回到了家，他看到袅袅激动地扑上出，泪如泉涌。羞羞，羞羞……我以为你走了……再也不回来了……

不喜欢矫情的羞羞一爪子拍开他，眼角却有透明的液体。

袅袅回到了这件屋子。回到了人类世界。

她还是羞羞，不是袅袅。

生命森林的动物们制定了很多的袅袅的浪子回归路计划。连猫妈都出动了。

羞羞不为所动依然淡定地在人类世界当一条普通的白猫。

篇（6）

比如李嘉诚在内地保健品领域，就拥有不小的话语权。

羊胎素、有机奶粉、专供孕妇食用的 DHA产品，以及某些内地学生逢大考前常常吃的保健品，都有李嘉诚的产业。准确地说，这些产业都归拢在和记黄埔旗下的和黄健宝保健品有限公司，这家公司成立已超过10年。

求医问药时，有些常用药，比如板蓝根颗粒、复方丹参片，也有李嘉诚的影子。

和记黄埔旗下有专门的医药科技公司，在医药行业是不折不扣的“隐形大户”，势力覆盖“北上广”李嘉诚在北京与同仁堂合作，在上海开办有上海和黄医药有限公司，在广州与白云山医药合资建厂。

2004年时，李嘉诚明确定调：中药将是和记黄埔的第六大支柱产业。紧跟着在2006年，李嘉诚就将他的医药公司名单，挂上了欧洲的伦敦交易所，成了笔跨国大生意。 2011年5月20日，香港，李嘉诚在公司股东会后出席新闻会。

另外一个巨头雀巢公司就看中了李嘉诚在中药产业上的判断，更看中李嘉诚在中药行业隐秘深耕多年的家底：和记黄埔的中药材库十分巨大，包括1200多种药用植物的5万种提取物。去年年底，雀巢第一次涉足中药产业在此之前，这家瑞士公司也确实在尝试做一些实验，比如在婴儿米粉中加入绿豆和莲子，让产品能“去火”。

雀巢现在与李嘉诚合伙开办了一家公司，希望可以找到用中药治疗肠胃病的办法。

总之，热衷于进入医药行业，这一点李嘉诚与比尔·盖茨的投资兴趣很像。

除此之外，一个日化品牌白猫洗洁精，从2006年开始，就已经是李嘉诚的无形资产。2006年和记黄埔收购了白猫集团所持有的上海白猫有限公司80%的股份，共同组建上海和黄白猫有限公司，也就是“和黄白猫”。2009年4月，白猫集团又将“白猫”商标转给和黄白猫，所以在市场上看到的“白猫”洗涤产品，已经盖上了李嘉诚的烙印。

需要说明的是，“白猫”其实有两个，另一个“白猫”是白猫股份，是一家经营不善的上市公司，2010年已退市。其间两只“白猫”乌龙不断，引得和记黄埔的新闻发言人要不时澄清：这只白猫和李嘉诚没关系。

李嘉诚在另一个时髦领域互联网、IT行业的投资令人感觉距离感更小。

他投过facebook、skype，以及后来被苹果公司买走的语音助手软件Siri。投facebook的决策时间只花了五分钟，而当时的facebook尚未营收。五年间，他手中所持的3%股权，回报率高达580%，据估计，他能从中赚得20多亿美元。李嘉诚却表示，在自己投资的新科技公司中，facebook赚得未必最多。

为他物色高科技企业的公司叫维港投资，专注于中早期科技类项目其操盘者正是五分钟内说服李投facebook的周凯旋。据《经济观察报》报道，维港投资团队成员只有四名，一贯低调，没有官方网站，却能凭其遍布全球的团队，挖掘出一般人不易察觉的项目。

再往近了说，我们的“衣食住行”，也有“李嘉诚牌。”华南地区能吃到的东北大米，会有一部分来自和记黄埔在黑龙江的生产基地。《证券时报》曾经报道说，在中国入世前，李嘉诚受邀到黑龙江投资稻米，并于1998年成立合资企业，开发近150万平方公里产粮地。

篇（7）

2岁以前

女儿出生后几天，从广州天河区妇产医院回家时，在家里欢迎她的就有一条司爱的长毛小狗花花。花花颇有灵性，很快就明自了小宝宝在我们家中的地位，从来也不敢去碰一下孩子，只是不近不远地守着，而且非常尽职。女儿三四个月大的时候，似乎不会哭，她醒来时，没什么声响，我们不在房间，自然就感觉不到女儿醒来。这时，花花就会来扯我们的裤腿或鞋子，引我们去孩子的房间。女儿非常喜爱花花，只是后来给女儿看病的医生数落我们不注意卫生，我们才把花花关到了阳台上。可女儿还是每天要去阳台看一看花花，有时还要连去几次。

女儿1周岁，我们到了重庆，住在郊区农村的外婆家，又有了养狗的条件。一天，有个狗贩子牵着几条土狗到我们屋前，并介绍其中的一条特别凶，我却偏要去摸一下那条狗。奇怪的是，它对我显得特别温顺。看是有缘，我就把它留下了。这是我专门买给我女儿的第一条狗。狗贩子叫它“小狗”，我们也叫它“小狗”。它礁实很凶，尽管有铁链锁着，也经常要；中出去咬人。

女儿却对它宠爱有加。所有，的好东西，都要拿去喂它。吃饭一定要和“小狗”分享，就连她拉出的屎也要留给它吃。平常女儿爱摸摸狗的耳朵、揪揪它的尾巴，后来还要骑到它的背上，那小狗总是俯首听命的样子，挨着小主人。但它对陌生的路人，仍然是那么凶。有一回，一个路人经过，我女儿命令它：“冲，”它真的吼着冲了出去，虽有链子拴着，也着实把路人吓了一跳。后来我才明白：它那么凶，是因为它已怀有仔仔，怀仔的母狗是要比平时更凶一些。不久，“小狗”就生了两个仔仔公的叫阿旺，母的叫阿彩，这可把我女儿乐坏了。她经常提着、抱着两只小狗，有时还抱到我们睡觉的床上去，屡禁不止。看着她对小动物的那种深爱，我时常不顾妻子的反对，网开一面，由着她在床上同小狗嬉戏。孩子与小动物一起玩，能自然地表现她内心的爱，也能通过与动物的接触，了解动物。动物世界恐怕是幼儿对外界感知最乐意探究的一个世界了。

除了“小狗”，我还先后给女儿买了一只白猫和一只花描。那只白猫看起来就挺可爱，只是冬天老要跳到我们床上来睡觉。挥之不去，简直无奈它何。而且，不见它捉老鼠；捉老鼠的事情是由“小狗”代庖的。可是我女儿却非常喜欢它。后来，那只白猫出去就再也没有回来。我女儿很伤心，在给几十公里外的我打电话时，首先告诉我的就是白猫的事。为了安抚女儿，我又买回一只花描。可是不久，花猫误食老鼠药而死了。我女儿又不免伤心一阵。后来，我们一家三口搬到重庆市里去住，就无法养狗养猫了。但是，我们会天天带女儿去重庆的市府广场，吃过晚饭后，那里有很多出来溜狗的，各种各样的狗，应有尽有。看到每条拘，女儿都要去逗逗。而且，广场的一角还养着一群鸽子，女儿非常喜爱在那里喂鸽了。

2岁队后

从重庆经上海再到浙江的海盐后，我们又有了养小动物的空间。最多的时候，我家有一只小狗、一只小猫和各种鸟(十几只)，一大堆小动物，非常热闹。这时候，女儿玩着动物已学会了不少有关动物的英语单词 和短句子。渐渐地，女儿对猫咪情有独钟。

女儿自号Sister Cat，模仿猫的动作、神态，每天要督促我们别忘了给猫咪买小鱼。最有趣的是，女儿看了一部描写外国科学家饲养动物，并进行研究的片子，看到他们用英语与动物沟通，她就认为动物能听懂英语，而听不懂中文。所以，她时常会与她可爱的猫咪说一大堆英语。她还给这只猫咪起了个英语名字：Angel(天使)。我问她为什么起这个名字?她说：“我的名字是Angella，我是她姐姐，我的妹妹就应该叫Angel。”听起来还颇有道理。

对小动物的喜爱，也带动了女儿的学习。比如全神贯注地观看有关动物的动画片；学画动物；不厌其烦地反复学习有关动物的中外文字，她第一个脱口而出的日语就是neko(猫)！乃至教她的《咏蛙》诗，她也学得津津有味，读几遍即能成诵。更没想到，过一些天，女儿还根据的《咏蛙》，改出了她的《咏猫》诗。

《咏蛙》

／1909年

独坐池塘如虎踞，

绿荫树下养精神。

春来我不先开口，

哪个虫儿敢作声?

《咏猫》

女儿的改作／2004年12月

独坐客厅如虎踞，

桌子底下养精神。

篇（8）

话剧开始了，出现了独眼狼、单眼狼，他们被关进大牢里，外面有很多士兵守卫。就在这个时候，臭狐狸代表大灰狼来看他们。它手里拿着一盒曲奇饼干，说：“我特意代表大灰狼来看你们了，这盒饼干是我们的一点心意。当年大灰狼和你们一起坐牢，可是被一场海啸分开了，这次我们找到了你们，特意送来饼干，表示一点心意……”

狐狸走了，卫兵也走了。独眼狼和单眼狼食偷偷地把曲奇饼干盒打开，他们发现盒子里面有一个纸条和一把万能钥匙，他们说：“这一定是大狼给我们的。”然后他们说，这两天一定会来一场大大的雷阵雨，所以要它们趁雷阵雨和雾气很大时把门偷偷打开，逃出去。

当然，这个计划成功了。半路上，突然听到黑猫警长的声音，他们拼命的逃，逃到了一家超市店门口，因为今天有雷雨，超市提前关门。他们突然想起自己手中有一把万能钥匙，他们就用万能钥匙把门打开，进入超市偷走了很多东西，把肚子也填饱饱的了。

可当出来的时候，发现黑猫警长把他们包围了。这时，大狼和狐狸从四周杀来救他们，于时他们冲出了包围。坏蛋们一起逃啊逃啊，突然发现黑猫警长在前面拦住了他们，白猫警长和小鹿警官在后面拦住了他们，使他们无路可逃，又被关进了大牢。

篇（9）

这三节课的共同点是：

一、基本上都落实了学讲计划的精神，先学后教，给足了学生自主学习的时间，整个教学过程中渗透了学生的自学、互学，教学的痕迹。突出了学生的主体地位，教师退到了后面，给足了学生充分展示自己的机会，教师主要发挥四两拨千斤的作用。

二、课堂教学有重点突出，教师对于教材的解读深刻，有新意，教学程序设计巧妙，环环相扣，条理清晰。教学过程中，重视对学生的朗读训练，形式多样，教师指导到位。

三、教师教态自然大方，在上课前都注重课堂管理，采用交谈，夸赞、鼓励性的话语拉近与学生的距离，让学生入情入境，充分调动学生的学习积极性，课堂气氛活跃。在教学过程中，教师语言亲切柔和，对学生的表现，评价及时中肯。

这三节课体现了三种不同的风格：

第一节宋颖老师执教的《桂花雨》，就如宋老师给人的春风化雨般的感觉一样，温柔舒适，亲切柔和，真有如沐春风般的感觉。尤其是指导朗读很有特色，善于创设情景让学生入情入境。在指导朗读赞美桂花之香时，创设了四种情景让学生读，当桂花落在额头、鼻尖、衣袖、全身不同的情况下对桂花的赞美。再如理解"缠"时，又创设了一天之内的不同时间"缠"着妈妈问啥时摇桂花的情景，让学生朗读体会。最动情的地方是配乐朗读和电影般的情景再现似回读。宋老师选的配乐曲温婉动听，听了确实令人动情，加之宋老师高超的朗诵水平，确实让学生直接的感受到了怀念故乡之情。宋老师还联系了最后一句中怀念儿时摇桂花的情景，运用配乐的方式回读文章的第三节摇桂花的句子，再现了这一情景，真如电影回放一样，听这节课令人很感动。

篇（10）

小编大话:不由联想起大话西游的孙悟空面对紫霞时,动心则伤身,世间最痛苦之事莫过于此。

最聪明白猫:不爱吃鱼专吃草

一只大白猫先是拨弄着一堆枯草,从枯草中寻找起青草的根部来。过了老大一会后,它把头伸进枯草里闻,在草堆里咬起其中的几根嫩青草来,并津津有味地嚼起来。然而,令人意想不到的是,过了一会儿,在吃了多根青草后,这只小猫突然窜至路边一小轿车旁,在一处隐蔽的地方呕吐了起来,随后,它聪明地用爪子扒起土块,把呕吐物盖上才离开现场。

猫的主人朱先生称,小白猫名叫小白,至今年也才养了两年时间。平时它喜爱吃鱼,还有一些其它的肉食,有时喂苹果给它吃,但它闻都不闻。有时碰到素食,是宁可饿肚子也不吃,十分地倔强,还会“喵喵”地大叫,以示抗议。最近几天,朱先生才发现小白对青草如此好奇,有时还品尝。也是偶然之间,他发现猫有呕吐现象。

宠物专家称,可能这只白猫患了胃病,通过吃草来治疗。据其介绍,动物有一种天性,就像人类生了病,也能找到某种草药可以治愈一样。比如,当白猫的肚里有寄生虫或是患上消化道疾病时,往往就会发生胡乱吞草的情形,以此来达到催吐之效,从而把令其身体不适的东西吐出来。

小编大话:猫中“神农”惊现世间,不靠兽医能自诊。

最星范儿动物:修炼成精的牧羊犬

现年10岁的英格兰牧羊犬“蓝色”自从6个月时便跟随主人模仿台球动作,如今竟无师自通地学会了打台球。由于球技高超,他已经成了远近闻名的“台球神犬”。“蓝色”是一条博德牧羊犬,它的主人介绍,“蓝色”对台球怀有天然的兴趣。每当主人在酒吧举杆打球时,“蓝色”便会聚精会神地在一旁观察。随着个头的长大,“蓝色”无师自通地学会了打台球。它总是用两条后腿站立,抬起两条前腿伏在球案边上认真瞄准,最后用前爪猛地撞击一下主人事先为它架好的球杆。每当彩球应声落袋,“蓝色”都会兴奋地围着球桌跑几圈。

小编大话:如今宠物们可不甘心单调的生活,他们也能大胆秀自己。

最佳和平奖:海豚与老虎惺惺相惜见面吐泡泡问好

在自然界,海豚和老虎几乎难以相遇。不过,在美国加利福尼亚六旗探索王国游乐园,一只宽吻海豚(bottlenose)竟然和一只孟加拉老虎结为了好友,在相见"小虎妹" 时还会以吐泡泡的独特方式问好。

这只名叫马利克的宽吻海豚似乎对孟加拉虎崽阿卡萨心存好感。每当这只孟加拉幼虎靠近玻璃水缸时,海豚马利克便会主动翘起头游到它跟前,并还会转过身子让它慢慢欣赏。

据了解,孟加拉雌性幼虎阿卡萨只有6个月大,而马利克则已有1年2个月大。据六旗探索王国游乐园(Six Flags Discovery Kingdom)的工作人员透露,"小虎妹"阿卡萨是在被饲养员带领散步时结识到了这位海豚好友。

小编大话:21世纪什么最重要?和谐嘛!

最怕冷少年:体温仅30℃

英国柴郡沃林顿市的14岁男孩本・布朗患有一种罕见的“下丘脑综合征”,这一怪病导致他的身体体温总是比常人的正常体温低7℃。只有30℃体温的他成了世界上“最怕冷的少年”,即使在烈日炎炎的大热天里,他也必须穿着厚厚的冬装,戴着羊毛帽,围着羊毛围巾,把自己裹得严严实实。稍不注意,他随时都可能陷入昏迷,引发生命危险。

布朗笑着说:“我的朋友们也希望体验一下我的疾病―――仅仅体验一次。不过老实说,我的疾病非常让人烦恼,我必须万分小心。如果我感到体温下降,我必须立即躺进浴缸中洗热水澡,并立即将自己裹得密不透风。不过,你不应该让这种事影响你的生活,你必须在生活中保持微笑。”

小编大话:小本・布朗应该搬到苏丹去,那是最适合他的地方。

最长的舌头:美长舌男用舌头舔眼睛发短信

美国加州20岁男孩尼克・阿法纳西耶夫号称拥有全美最长的舌头,他可以轻松地用舌头舔到自己的眼睛,还能用舌头来发短信,相当神奇。

靠着自己的这项特长,尼克上遍所有的电视节目做宣传。在一次直播中,女主播忍不住好奇,用尺子对尼克的舌头进行了测量。测量结果显示,舌头长9厘米,接近世界纪录了。

尼克的另一项绝活是用舌头发短信,他用舌头在手机上写字,然后熟练地发出一条信息。他开玩笑说:“开车手没空时,舌头就可以发短信。”

目前,他靠着长舌拍了50多部影片,《变形金刚3》剧组也邀请他演出。

小编大话:但愿他的舌头不要再生长了,否则他的嘴巴容不下,将来不得不像猎犬一样将舌头从嘴巴中耷拉出来。

最震撼的服务:超级接客时地动山摇

日前,德国一名被邻居告上法庭。原因不是非法,而是她接客时动静太大,常常让邻居们感觉“地动山摇”。

这位名叫伊尔内斯・洛尔巴赫,体重竟达230斤。她的邻居卡洛尔索・霍夫曼抱怨称:“我感觉就像身处电影《大地震》中的情景。不知道是不是她或者她的客人让大地都震了起来,但我们确实感觉到震动。”不过,洛尔巴赫也有让人同情的一面――她是一位单身母亲。目前,她正计划让自己的“工作”合法化,希望能在德国拿到许可,然后用自己的房子开一家小型妓院。

洛尔巴赫的邻居霍夫曼在接受《太阳报》的采访时说:“每当她接客的时候,我家里书架上的水晶饰品就会掉下来,墙上的画也会散落得到处都是。与此同时,洛尔巴赫也对邻居们充满歉意。上周,由于她的“过失”,邻居家的一对名贵的杯子被打坏。据称,每个杯子都价值100英镑。

36岁的洛尔巴赫在接受采访时说:“一个单身母亲靠这种方式糊口确实很难,但我努力让自己变得勤劳,让不可能变成可能。”目前,距离法庭的宣判还有一段时间,同样身为女性的法官尚未决定该如何判决。

小编大话:还是勤劳致富吧!

最潮新品:解放鞋大变身受追捧

你家还有老底子的解放鞋吗?有的话,赶紧擦擦灰,穿起来。如今,日本最新潮品就是解放鞋,而且改良版的解放鞋在欧美成时尚宠儿,身价堪比耐克。

千万别诧异,这种早就被国人遗弃的布鞋,摇身一变已成了时尚新宠儿。在美国,一双改良过的解放鞋甚至卖到了65美元,跟国际知名品牌NIKE同等价位。”网友们的议论也很热烈:有的说下次出国要批发一堆解放鞋带出去;还有的说,如果我手挽一只LV的编丝袋、脚蹬一双绿色解放鞋,那我就是最时尚的人了!

小编大话:中国元素越来越多的展现在世界面前,被时尚人士追捧。

最捉弄人的软件:“测出你有多丑” 随机送毒舌评语

当一款软件智能到可以评论一个人的长相时,人们就会大呼过瘾了,但当它还随机附送毒舌评语时,被评丑的人就不得不捶胸顿足了。

据悉,一款在iPhone上使用的名为“丑脸评分表”(UglyMeter)的应用程序面世,声称可以“测出你有多丑”。只要拿着iPhone对着人脸或照片进行拍摄,这款软件就会实时分析照片中人的面部轮廓,并给出一个分数,分数越高,说明长相越“丑”,其中最高分为10分。最有趣的是,这款软件还能随机给出毒舌评语,令人捧腹。

有好事者用“丑脸评分表”给几位家喻户晓的“明星脸”打分。中国台湾名模林志玲最讨此软件欢心。林志玲被评为1.2分级的超级美女。紧随其后的好莱坞影星安吉丽娜・朱莉得分只有2分,如此低的分数说明“美女是经得起各种考验的”。

小编大话:这可是最整蛊人的玩意了,即使机器和人类的审美观有差异,但机器是不会撒谎的。