核酶的化学本质汇总十篇

序论：好文章的创作是一个不断探索和完善的过程，我们为您推荐十篇核酶的化学本质范例，希望它们能助您一臂之力，提升您的阅读品质，带来更深刻的阅读感受。

篇（1）

反例教学法是指教师呈现少数精选的特例，引导学生进行批判的一种教学方法。因为反例教学法是从教学实际中来的，所以此种教学方法具有真实、生动的特点，能激发学生积极的情感，引起学生内心的共鸣，活跃学生的思维。反例教学法使用得当，一定能收到比正面切入更好的效果。

1. 光合作用一定需要叶绿体吗？

举个简单的反例吧，蓝藻是原核生物，并没有叶绿体这种细胞器，但它依然能够凭借体内的藻蓝素进行光合作用，把太阳能转化为有机物中稳定的化学能，所以光合作用必须要有光合色素，但并不一定需要叶绿体。

2. 生态系统中的生产者一定进行光合作用吗？

反例是硝化细菌只能进行化能合成作用。生产者属于自养生物，因此包括：

①进行光合作用的绿色植物；②进行化能合成作用的细菌，如硝化细菌、硫细菌等；③进行光合作用的细菌，例如光合细菌等。

光合作用和化能合成作用都是自养的方式。主要不同点是：直接能源不同，光合作用的直接能源是光能，而硝化作用的直接能源是化学能，硝化细菌将氨气氧化，形成硝酸：

2NH3+3O22HNO2+2H2O 2HNO2+O22HNO3在这两步反应中都释放出化学能，将无机物合成有机物。

3. 动物在生态系统中的成分一定是消费者吗？

不一定。动物绝大多数是消费者，有少部分是分解者，如屎克螂、蚯蚓，甚至大型动物如秃鹫等。

4. 进行有氧呼吸的生物一定有线粒体吗？

不一定。好氧细菌，专性好氧菌，兼性厌氧菌等细菌只有核糖体而无其它细胞器，也能进行有氧呼吸，原因是含有跟有氧呼吸有关的酶，它们散布在细胞质基质内，有的也在细胞膜内膜上。效率是比拥有线粒体的细胞低的，而线粒体是真核生物主要提供能量的“动力车间”。

5. 单细胞的生物一定是原核生物吗？

不一定。酵母菌是单细胞生物，但是真核生物。原生动物都是真核生物，但也是单细胞的生物。例如：草履虫，变形虫。

6. 酶的化学本质一定是蛋白质吗？

不一定。酶的化学本质大多数是蛋白质，少部分是RNA。

化学本质是RNA的酶指核酶。核酶是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。核酶与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。

7. 真核细胞中的DNA一定分布在细胞核中吗？

不一定。DNA主要在细胞核内，线粒体，叶绿体的基质也有。

8. 真核细胞中的RNA一定分布在细胞质中吗？

不一定。RNA主要在细胞质内，还有少数在细胞核和核糖体内。

9. 所有的植物在生态系统中一定是生产者吗？

不一定。 如： 菟丝子不能进行光合作用，只能营寄生生活，所以不属于生产者。

10. 生态系统中所有的细菌一定是分解者吗？

不一定。营腐生生活的细菌是分解者，而硝化细菌能进行化能合成作用，属于自养生物。在生态系统中属于生产者。

篇（2）

首先,大多数的蛋白酶在高温下分子结构遭到破坏,并失去了活性,特别是大多数的蛋白酶,因为蛋白质的变性而失去活性,这种变性大多是不可逆的,而且随着温度的升高,这种变性更无恢复的可能,也就是说曲线的右侧的某一位置上应该与横坐标有一个交点,而课本上的插图没有。为此笔者完整地摘录了《生化简明教程》插图如下:

从图上可以明确看出右侧也没有交点。对于蛋白类的酶来说,高温时失去活性是肯定的,是不是对于核酶来说有例外呢?笔者专门请教了南京师范大学的教授,得到的回答也是肯定的,RNA酶在高温下也会失去活性,也就是说即使是核酶也应该有一个交点。

其次,在低温下,酶的活性也会受到抑制,由于它的分子结构没有被破坏,所以在适宜的条件下可以恢复,而在日常生活中也可以利用这一点来保存酶,而从《生物化学简明教程》的上述插图可以看出,左侧是从原点开始的,也就是说有一个交点。蛋白质类的酶在低温下一般不会发生变性,但活性极低,甚至可以低到难以检测的程度,RNA酶在低温下的活性也可能会很低,因此,给出这个交点倒是能够让人理解的。但酶在高温下会发生变性,变性以后酶的活性大部分将会完全丧失,最适作用温度高温一侧也必定存在一个交点,不给出这个交点无法让人理解。

第三,酶的最适作用温度不是一个固定不变的常数,其数值受到底物、种类、作用等因素的影响而改变,例如,酶的作用时间长短不同,所求的最适作用温度亦不同,作用时间愈长,最适作用温度愈低,作用时间愈短,最适作用温度则愈高。其实只有在一定的条件下各种酶才有其一定的最适作用温度,通常动物体内酶的最适作用温度在37-50℃,植物体内的酶的最适作用温度在50-60℃。

第四,和一般化学反应相同,酶的反应在一定的温度范围0-40℃内,其速度随温度的升高而升高,根据一般经验每升高10℃的反应速度增加一倍,高温下酶易失活,绝大多数酶在60℃即失去活性,故此,最适作用温度的右侧下降的幅度应该较大,左侧上升的幅度应该相对较慢,曲线的两侧也应该不会程明显的对称。

综上所述,酶在一定的条件下有一个最适温度,并且在最适温度两侧应该是不对称,左侧和横坐标无限接近,右侧和横轴在某一位置有一个交点。所以酶受温度的影响曲线应该大体上是这样一个趋势:

当然,蛋白酶和核酶在特性上有一定的差异,曲线也应该有所变动。

另外,从曲线上无法直接反映出来的是,蛋白质的变性作用如不过于剧烈,是一种可逆反应。这一点在教学过程中往往也无法作出解释。例如,胃蛋白酶加热至80-90℃时,失去溶解性,也无消化的能力,如将温度再降低到点37℃则它又可恢复溶解性与消化蛋白的能力,但随着变性时间的增加、条件的加剧,变性程度也加深,如蛋白质的结絮作用和凝固作用就是变性程度深刻化,这样就达到不可逆的变性。这些也绝不是一个图就可以说明的。当然上述是笔者的一孔之见,错误在所难免,请各位同仁不吝赐教。

参考文献:

1.全日制普通高级中学教科书《生物》必修第一册,人民教育出版社自然编著室编著

2.《生物化学简明教程》高等教育出版社第三版由罗纪盛等编著

篇（3）

纳米材料表面能量转移（Nanomaterials surface energy transfer，NSET）在分析化学及生物药物分析等领域被广泛应用，如示踪DNA或蛋白质分子的构象改变，识别DNA折叠的中间产物，监测DNA与金属离子的相互作用以及测定与疾病相关的重要生物分子＼[1～4＼]。在本质上，NSET是偶极偶极相互作用，它与荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的不同之处在于NSET的能量受体是纳米粒子表面，其通过在几何学上各向同性的偶极向量分布接受供体的能量。NSET增大了供受体之间的能量转移效率，相比FRET，它具有两个重要特点＼[5，6＼]：同一个纳米粒子能猝灭从可见到近红外发射波长的荧光；能量转移效率与距离的关系从1/R6变成1/R4，使得NSET的有效作用距离（约15 nm）比FRET（9 nm）增大了约2倍＼[6＼]。

铅污染是一种分布广泛的重金属污染，它能导致人体肾脏损伤和智力发育迟滞＼[7＼]。因此，发展简单灵敏的实时监测环境中Pb2+污染的方法意义重大。目前，基于脱氧核酶的铅离子传感器由于其高灵敏度和高选择性被广泛地用于测定水中Pb2+ ＼[8～14＼]。例如Lu等利用脱氧核酶建立了一系列比色法＼[10～12＼]和荧光共振能量转移法＼[13＼]用于测定Pb2+。Pb2+脱氧核酶是由一个酶及底物链构成，当Pb2+存在时，脱氧核酶可以催化底物链发生特异性的水解断裂。这一特性常被用来控制纳米粒子聚集和荧光共振能量转移供受体之间的距离。在这些方法中，灵敏度和选择性都较好，但是由于所用脱氧核酶发生特异性水解断裂的过程需要严格的反应条件，使得操作过程比较复杂。

研究发现，Pb2+由于具有与G四链体结构空腔尺寸适合的离子半径（r =0.129 nm）以及与碱基的强配位作用，能与富含G碱基的寡聚核苷酸链形成稳定的G四链体结构＼[15＼]。近来有研究报道，凝血酶适配体（Thrombinbinding aptamer，TBA，5′GGT TGG TGT GGT TGG3′） 就可以选择性地与Pb2+形成G四链体＼[16＼]。本研究中在TBA DNA的5′端修饰上荧光染料FAM作为能量供体，利用柠檬酸根稳定的球形金纳米粒子作为能量受体，通过表面能量转移建立了测定水溶液中Pb2+的分析方法。在Pb2+诱导下，该DNA链从自由缠绕状态转变成G四链体。由于单链DNA和G四链体的DNA（或双链DNA）具有不同的静电特性，对金纳米粒子具有不同的吸附能力＼[17＼]。因此，与Pb2+浓度相关的DNA折叠过程会改变金纳米粒子与染料分子之间的距离，从而影响两者之间的能量转移效率，具体体现在染料荧光强度的变化。本方法通过监测体系的荧光强度变化就可以简单灵敏地实现对Pb2+的定量检测。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Hitachi F2500型荧光分光光度计（日本日立公司），以485 nm激发，500～600 nm 之间扫描荧光发射光谱。Shimadzu UV3600 型紫外可见近红外分光光度计（日本岛津公司）；PHS3C 型酸度计（成都世纪方舟科技开发公司）； QL901型漩涡混合器（江苏其林贝尔仪器制造有限公司）； 901型恒温磁力搅拌器（上海精科实业有限公司）。

HAuCl4・4H2O（上海国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸三钠（上海化学试剂公司）；Pb（NO3）2（重庆川东化工试剂公司）；荧光素修饰的单链DNA（5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′，上海生工生物工程技术与服务有限公司合成）。将DNA干粉以5000 r/min离心5 min后，加入1 mL新煮沸并冷却的超纯水混匀，4 ℃下保存待用。实验用水均为超纯水（重庆利迪现代水技术设备有限公司LD50GE型超纯水机制备，18.2 MΩ cm）。实验中使用三羟甲基氨基甲烷乙酸（TrisHAc）缓冲溶液控制溶液酸度。试剂均为分析纯。

2.2实验方法

2.2.1金纳米粒子（AuNPs）的合成根据文献＼[18＼] 的方法稍作修改合成了柠檬酸根稳定的AuNPs。具体步骤为：在100 mL 平底烧瓶中依次加入49 mL 超纯水，1 mL 1% HAuCl4，磁力搅拌下加热至沸腾；剧烈搅拌下迅速加入1 mL 5% 柠檬酸三钠，溶液的颜色变为浅黄色；继续磁力搅拌并使溶液保持沸腾，5 min内可观察到溶液的颜色从浅黄色经由蓝黑色，最终转变为鲜红色；停止加热，继续搅拌直至溶液冷却至室温。测得该溶液的LSPR峰最大吸收波长在520 nm处。其浓度依照LSPR消光光谱和朗伯

3结果与讨论

3.1NSET传感法检测铅离子的原理

因而与AuNPs之间具有强烈的亲和力，使得TBA很容易被吸附到金纳米粒子表面＼[17＼]。通过TBA在金纳米粒子表面的吸附，修饰于TBA上的FAM染料分子可以靠近金纳米粒子，发生从FAM到金纳米粒子表面的能量转移，使得FAM染料的荧光被猝灭。当加入Pb2+后，TBA由于含有9个G碱基，它们能与Pb2+特异性结合，使TBA从自由缠绕结构转变为G四链体。由于G四链体中暴露在外的是带负电荷的磷酸盐骨架，它们与带负电荷的金纳米粒子之间能产生强烈的静电排斥力＼[17＼]，显著增加了TBA上携带的染料分子与金纳米粒子之间的距离，减弱了染料分子与金纳米粒子之间的表面能量转移，体系的荧光信号得到恢复。在一定范围内，形成四链体的程度与Pb2+加入浓度成正比，使得体系的荧光强度也与Pb2+浓度成正比，据此建立了基于表面能量转移的分析方法用于定量测定水中的Pb2+的方法。

为了示踪Pb2+引起的TBA构象改变以及与AuNPs之间的表面能量转移，利用普通的荧光分光光度计分别测定Pb2+存在与否情况下修饰于TBA链上的FAM的荧光强度（图2）。从图2可见，在没有AuNPs和Pb2+存在情况下，FAMTBA在520 nm处展示出很强的荧光发射（图2a）；当加入AuNPs后，由于AuNPs与FAM之间有效的表面能量转移，FAMTBA的荧光几乎被完全猝灭（图2c）。这一现象与文献＼[21＼]所观察到的金纳米粒子对荧光团有较高猝灭效率是一致的。而当Pb2+和AuNPs均被加入体系中时，由于Pb2+诱导FAMTBA的构象发生改变，使得FAM与AuNPs的距离大大增加，降低了表面能量转移的效率，从而使荧光得到一定程度的恢复（图2b），据此实现对Pb2+的检测。

3.2其它金属离子的响应3.3线性范围及实际应用

在最优实验条件下，利用TBA探针基于表面能量转移选择性测定Pb2+。在Pb2+浓度为12.5～100 nmol/L范围内，获得了荧光恢复效率（F/F0）与Pb2+浓度间的线性关系，线性回归方程为y=0.910+0.007c （y为体系的荧光恢复效率F/F0，c为Pb2+浓度（nmol/L）， R2=0.997，图4），检出限（3σ）为10 nmol/L。 依据美国环境保护署（EPA）规定的饮用水中Pb2+浓度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L）的标准＼[13＼]，本方法对Pb2+的线性响应范围正好可用于监测饮用水中Pb2+的含量。采用标准样品加入法，对自来水中Pb2+进行定量检测。为避免次氯酸盐的强氧化性对实验的干扰，在分析之前，自来水需先煮沸。实验结果见表1，标准加入回收率结果令人满意。

4结论

通过Pb2+诱导FAMTBA形成G四链体，并基于FAM与AuNPs之间的表面能量转移，建立了一种简单、快速、灵敏的Pb2+传感方法。在最佳实验条件下，其检测线性范围为12.5～100 nmol/L，检出限（3σ）为10 nmol/L。美国环境保护署（EPA）规定饮用水中Pb2+浓度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L），故本方法可用于监测自来水中的Pb2+。

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篇（4）

21世纪是生物科学高速发展的时代，生命科学新突破、新进展引发人们对生命现象的持续关注，生物工程技术的应用使人们的生活发生了很大的变化，同时给社会生产带来了重大革新，这所有的变化都与生物化学学科的发展密切相关。生物化学是生物学各专业学生必修的一门专业基础课程，学生对这门课程的掌握程度直接影响对其他课程的接受情况，生物化学被列为很多专业如生物类、农业类、医学类等的考研或其他专业考试的科目，所以对该课程的掌握情况直接关系到学生的考研和就业。以全面培养学生的创新能力和综合素质为目标，该课程在教学队伍、教学内容、教学条件、教学方法与手段、教学网站建设、实验教学、教学质量和水平、科研等方面都取得了长足进展，逐渐形成了自己的特色和优势。2011年，生物化学被立项为临沂大学校级精品课程，2012年被立项为山东省省级精品课程。让学生在有限的时间内系统掌握生物化学知识和技能是教学的重要任务，然而在对2013级生物科学和生物技术专业学生的生物化学学习情况调查中发现，多数学生存在讲授内容不能完全掌握、学习兴趣不高等问题。在分析原因的过程中发现在理论和实验教学中依旧存在一些问题。为了有效激发学生的学习兴趣，培养其创新思维和实验能力，拟进一步深化教学改革，全面提高教育教学质量，现分析如下。

一、目前本课程所面临的问题

1.生物化学教材存在更新速度慢和部分重复的问题。目前生物化学课程所用教材门类繁多，但多数只重视生命的本质、生命的基本过程和基本规律，局限于以传统的静态生化、动态生化、机能生化为主的内容，而对生物化学的重大进展的重视不够。生物化学课程的实用性很强，新概念、新成就、新技术层出不穷，这些都没有体现在教材中，大大落后于学科的发展。生物化学还存在教学内容重复的问题，如糖、脂和维生素化学在无机化学和有机化学等课程中已经涉及其中大部分内容，而遗传物质和蛋白质的生物合成及基因表达调控等与分子生物学、细胞生物学、基因工程等课程有部分重复。

2.生物化学实验教学所占比例偏低，且验证性实验所占比例大。据统计，国外知名院校多单独开设生物化学实验课程，且实验学时数与理论时数的比例在1.0以上，本校生物化学实验学时较少，学时比为0.5左右。由于实验学时少，且验证性实验所占比例大，如考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、酵母RNA分离及组分鉴定等，而综合性、开放性实验所占比例小，学生普遍欠缺创新、设计能力，抑制了学生的主观能动性，束缚其科学思维能力的发展，非常不利于实验能力的培养。

3.实验教学方法单一。生物化学实验教学长期依附于理论教学而没有受到应有的重视。教学方法以传统讲授形式为主，很少进行问题引导，课堂上以教师为主体，在学生动手实验前，教师从实验原理、方法、步骤、注意事项，甚至实验过程中可能出现的问题都进行详细讲解，学生被动接受知识，照搬照做、步步模仿。教师在讲授过程中多以单一板书的形式进行，多媒体网络化教学手段没有或很少应用，且没有发挥出现代化教学手段的特色。

二、生物化学理论教学的优化———将生命科学最新进展与现有理论体系有机融合

为了解决生物化学教学内容陈旧、与其他学科存在内容重复的问题，许多学者提出了相应的解决方法。刘堰和肖训焰提出教学内容要与时俱进，具体指出在绪论中增加生物化学研究工作的现状与未来、在核酸化学中增加核酸的序列测定等内容。删除蛋白质化学中蛋白质的分类，维生素和辅酶中维生素的概念。胡晓倩等提出，学生在掌握生物化学基本知识和技能的基础上，要了解学科发展的前沿知识与高新技术。谢珍玉和郭伟良具体提出讲授内容的重点部分，部分章节分配到其他学科中进行重点讲解。生物化学教学内容的修改不是简单的增删或将部分章节分配到其他学科中讲述，在增删内容的同时需要解决该课程与其他课程内容的自然衔接问题，待添加的生命科学最新进展内容要与生物化学现有知识体系有机融合。如在讲述基因调控的章节中向学生介绍该研究领域的新热点———微RNA（microRNAs）。让学生了解microRNAs是由非蛋白编码基因转录物形成的茎环结构前体，由核酶剪切，成熟后形成长度为20～25nt的小RNA分子；真核生物、原核生物和病毒都可以编码mi-croRNAs；与教学内容中出现的小分子干扰RNA进行对应比较；通过讲述microRNAs的调控机制、功能、研究技术与方法、应用和前景使学生了解生命科学中该领域的最新发展趋势。

三、生物化学实验教学改革———围绕国计民生的热点问题设计实验

加大生物化学实验教学中综合性、开放性实验的比例，由培养学生基本实验技能为“指挥棒”的教学模式逐渐转变到培养学生创新性思维的模式中来。赵云涛等提出实验项目分为基础性、综合性、设计型和创新型实验。韩寒冰和刘杰凤提出加强自主性实验和研究性实验教学、培养学生创新性能力的观点。在培养创新应用型人才为目标的培养模式下，开展综合性、开放性实验的需求越来越迫切。开设这类实验的目的是拉近理论和实际应用的距离，让学生了解所学知识综合起来可用来解决实际问题，从而激发其创新思维，培养其创新能力。在考虑到理论与实验课程一致性和对应性的基础上，围绕国计民生的热点问题设计综合性、开放性实验作为实验教学改革的切入点，可用以解决教学中课堂与实验室、理论与实践相脱节的问题，并能实现各基础实验项目的有机结合。如2013年3月份报道临沂部分地区冬小麦出现严重病害，表现为受害小麦叶片发黄、枯萎、矮化，严重地块小麦完全枯死，导致这种病害的原因是小麦黄花叶病毒的侵染。据此设计小麦总RNA的提取及小麦黄花叶病毒检测的实验。提取小麦总RNA方法为实验室常规TRIzol法，通过植物总RNA提取实验使学生掌握核酸的基本组成、熟悉移液枪、离心机、研磨器的使用，让学生理解RNA提取对实验条件要求很高，原因是RNA酶无处不在，RNA易被RNA酶降解。随后进行反转录及RT-PCR，以小麦黄花叶病毒的特异性引物进行扩增，获得目的大小的特异性条带。在实验的过程中使学生掌握反转录、RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳等一系列生物化学基本操作。通过这类实践性强的实验将原有各自独立的实验统一到同一实验材料和同一题目下，实现各基础实验项目的有机结合，体现出知识的系统性和实验的研究性，同时同一题目下的各个小实验一步紧连一步，增强学生的研究兴趣。

四、生物化学实验教学方法的改革———由单一到多元化的教学方法

近五年来，我校实验中心引进一批具有博士学位的高学历人才作为实验员，这为生物化学实验教学改革注入了新的活力。这些实验员以直接或间接的方式参与生物化学实验教学，可缓解紧张的教师资源，并且他们知识丰富、思路开阔、创造能力强、创新欲望高，能大大提高实验教学质量。在实验教学过程中，实验员与本科生的年龄差别不大，兴趣爱好相近，他们之间交流较容易和顺畅，重要的是他们知道学生最想了解的是什么，能在相对轻松的环境中交流实验心得，讨论问题。对有独特想法的学生，在实验员及教师的指导下进一步深入研究，获得更多的锻炼。在进行实验教学方法改革的过程中，孔繁华等提出实验课“3+1”的教学方法；舒乐新等以启发式、归纳式、问题式、讨论式等教学法，让学生成为教学的主体，激发他们的主动性和创造性。在进行实验教学方法改革过程中以传统教学方法与现代多媒体技术相结合的手段，直观、生动地向学生展示实验内容，充分调动其积极性。采用启发式等的常规教学方法，要求学生在教师的启发下独立完成实验准备、实施与总结，引导学生独立思考、发现问题、解决问题，培养学生创新能力，形成开放式、互动式的教学模式。

五、结语

教学改革的目的是要增强学生素质的培养，加强对学生获得知识、运用知识的能力。通过改革优化，调整理论课程内容，使学习内容具有基础性、现实性和现代性。在理论与实验教学内容对应的前提下，以社会中的热点问题设计实验，将理论学习中的各种基础问题连贯起来，提高学生创新能力和实践兴趣。在精心调整生物化学教学内容的过程中，以新颖的实验教学方法实现实验教学效果的优化。生物化学内容复杂繁多，通过课程改革，学生在学习中得心应手，会促进其对其他课程的学习乃至对未来都会充满信心，这将非常有利于学生的人生发展，而这样的前景激励着我们在生物化学课程改革的道路上不断前进。

作者:王莹 王浩 井文倩 郗冬梅 单位:临沂大学生命科学学院 临沂罗西小学 临沂大学化学化工学院

参考文献：

篇（5）

【关键词】 乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR

血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判断乙型肝炎病毒在体内是否复制，患者传染性高低及选择治疗方案的重要指标。目前临床一般采用实时荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒DNA拷贝数进行定量检测。实时荧光定量PCR技术融汇了PCR技术的高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性等优点，通过直接检测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。但此技术可能与标本状态密切相关，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代谢产物可能与Taq酶相互作用，进而抑制Taq酶的活性，使PCR扩增效率明显降低，导致定量测定结果偏低［1］。在临床检验标本中，溶血标本较为常见，究竟溶血到何种程度会对乙型肝炎病毒DNA定量结果产生影响？本文将探讨不同程度溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。

对象与方法

1.对象 我们收集了ALT＞40 U/L、HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBcAb阳性的乙型肝炎患者30例，其中男性17例，女性13例，年龄在18～53岁之间。

2.试剂 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒（批号：20070501）、乙型肝炎病毒DNA阳性标准品。

3.仪器 BECKMAN全自动血球计数仪（型号：Coulter Ac.Tdiffe）、Lightcycle荧光PCR扩增仪(罗氏公司)、高速低温离心机（Sigma公司）、干式恒温器（杭州蓝焰科技有限公司）、低温冰箱（SANYO公司）。

4. 方法

（1）模拟溶血标本的制备：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小时内离心分离血清，这种不含Hb的血清作为无Hb对照组，然后取每位患者600 μl血清及适量红细胞混合，置于-20℃冰箱保存备用。次日将含红细胞的血清管取出放于室温解冻，完全解冻后再将该管置于-20℃冷冻，如此反复冻融两次，使得RBC完全破裂，释放出Hb。在Coulter全自动血球计数仪测定每管红细胞裂解后的Hb浓度，再用每位患者的血清稀释，使得Hb终浓度为4 g/L、8 g/L、16 g/L、32 g/L，这些标本即为模拟溶血标本。

（2）乙型肝炎病毒DNA模板制备：取待测样本及阴、阳性对照（试剂盒备有）各100 μl，分别加入到0.5 ml的离心管中，再分别加入100 μl DNA提取液1，震荡混匀，13000 rpm离心10 min；吸弃上清液，再加入25 μl提取液2，震荡至沉淀完全散开，100℃干浴10 min；冷至室温后，13000 rpm离心10 min，保留上清液备用。

（3）PCR扩增：从试剂盒中取出乙型肝炎病毒DNA扩增反应液、Taq酶及UNG，室温融化后按规定比例混合均匀，根据试剂盒说明书配置反应液，分装于Roche毛细扩增管中，每次实验均设2管阴性对照，1管强阳性对照，1管临界阳性对照， 4管乙型肝炎病毒阳性工作标准品，其拷贝数分别为〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷贝/ml，将上述对照及样本各加2 μl于加好反应液的Roche毛细管中，短暂离心后上机扩增。对检测结果高于5.0×107拷贝/ml的标本进行稀释后再扩增，使其结果落在试剂盒检测线形范围内。

（4）核酸扩增与荧光数据采集：扩增条件设置为37℃孵育3分钟； 94℃变性1分钟；再进入40个循环，每一个循环包括92℃变性5秒，60℃退火及延伸30秒，在60℃时单点收集荧光信号；仪器检测通道选择F1通道。

（5）分析条件设定：选择F1通道，点击Quantification进入定量分析窗口，设定Analysis方式为proportional，选定Noise bank项，阈值选定为刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数据为准。

（6）数据分析：四个阳性标准品Ct值均须小于38.0，标准曲线的拟合度须小于-0.980，阴阳对照品扩增须符合预期要求，得出的待测样品的拷贝数才为可信结果。

5.统计学处理 将测得的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换成常用对数，再利用SPSS软件包进行统计，各含Hb的血清组与无Hb的血清组间差异采用配对t检验进行差异性检验。

结果

Hb为4、8、16、及32 g/L的血清组中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与无Hb的血清组分别进行配对t检验，P值均大于0.05，因此每一组含Hb的乙型肝炎病毒DNA拷贝数与不含Hb的血清组均无显著性差异。见表1。

表1 各组乙型肝炎病毒DNA拷贝数及统计量（略）

讨论

实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA已在临床广泛使用，但在临床应用中，影响的因素也较多，如实验室条件，操作人员的技术，临床标本的状态等。一些研究认为溶血标本对FQPCR技术检测乙肝病毒DNA有影响，但也有研究认为这种影响并不显著［2］。本文通过模拟不同程度溶血标本，认为溶血达到32 g/L对检测结果无显著影响（P＞0.05）。陈英剑等认为溶血至20 g/L时对检测结果无影响，这与本文研究结论基本一致［3］。

本文将乙型肝炎患者抽血后2小时内分离的血清作无Hb对照组，然后通过反复冻融使标本溶血，再用乙型肝炎患者自身血清稀释以获得不同Hb浓度溶血标本，在模拟不同程度溶血标本过程中，不添加任何外来物质，使检测结果受外在因素影响程度减少到最低。实验结果经统计处理后，发现溶血程度控制Hb的浓度在32 g/L以下时，对乙型肝炎病毒DNA的检测结果无显著影响（P＞0.05）。出现此结果的原因可能有两个方面，一是在HBVDNA模板的提取过程中，标本中的Hb经100℃煮沸10分钟后已经变性沉淀，再经离心后，待测样本上清液中可能不会有Hb的存在，仅剩Hb的衍生物［4］。而且随着提取方法的不断改进，提取液中对DNA聚合酶的干扰物质不断减少，去除Hb越来越彻底。另一方面FQPCR对乙肝病毒DNA定量检测只是一种半定量方法，并不是对扩增后终产量进行完全定量，它是根据样本可检测的起始扩增时间与标准品扩增曲线得出的半定量结果。本文收集的30例病人的血清中HBVDNA含量均大于107 拷贝/ml，样本中HBVDNA含量较高，血清中HBVDNA含量小于107 拷贝/ml时，检测结果是否有差异，尚需进一步研究。且本文只对溶血程度小于32 g/L时进行探讨，溶血大于32 g/L时对检测结果的影响，也需进一步验证再作结论。溶血程度达到32 g/L时已是肉眼非常清晰可见，临床溶血样本的溶血程度大多在32 g/L以下，因此我们认为一般的溶血样本可以接受。但需注意的是，本文只是对深圳匹基公司试剂进行探讨，不同厂家，可能因使用不同的提取液及提取方法而出现不同的结论，有文献报道，使用PEG沉淀煮沸法和直接加热煮沸法提取HBVDNA所得的定量结果有差异，因此不同提取方法对检测结果有一定的影响［5］。一般而言厂家提供试剂时会给出较为清晰的影响试剂盒使用的各种因素，有能力的PCR实验室在试剂使用前，可进行此类评价实验，制订合适本实验室使用标本留取标准。随着卫生事业的发展，人们对检验质量的的要求越来越高，但检验质量不可避免的受较多因素影响，标本质量是重要的影响因素之一，如溶血、脂血、餐前、餐后等，对各项影响因素进行量化研究，如溶血、脂血达到何程度时则定为不合格样本，都应该有明确的指标。本文只对溶血程度小于32 g/L时进行探讨，溶血大于32 g/L时及血清中HBVDNA含量小于107 拷贝/ml拷贝时对检测结果的影响，需进一步验证再作结论。

参考文献

［1］黄 翔，王日军，周志明，等.溶血和脂血标本中乙肝病毒DNA提取方法的选择与评价［J］.华中医学杂志，2004，28（02）：123-124.

［2］李金明，王露楠. 样本处理对聚核酶链反应测定乙肝病毒核酸的的影响［J］.中华检验医学杂志，2000，23（6）：337-339.

篇（6）

药品专利保护问题一直是我国医药产业发展的薄弱环节。由于法规体系的不健全以及专利保护意识淡薄，使得许多原本我国拥有自主知识产权的成果都因此落得“为他人做嫁衣裳”的命运。这些教训告诉我们：要实现制药大国向制药强国的转变，我们首先必须努力实现向药品知识产权强国的转变。因此，作为行政主体的政府和市场主体的企业都必须增强专利保护意识，而其中―个重要方面，就是要加强对专利保护制度的研究，尤其是国外先进制度的研究，以取长补短。美国临时专利申请规定是美国对其专利保护制度进行创新的典型，对它进行研究具有一定的积极意义。

1　美国的临时专利申请规定

1．1 什么是临时专利申请规定 临时专利申请(provisionalpatentapplication，PPA)规定是美国专利商标局于1995年6月9日在美国国内率先提出实施的，是美国在乌拉圭回合谈判之后，根据谈判协议修改其专利法的产物。临时专利申请规定主要涉及美国专利法的两个条款，即第111条(b)款和第119条(e)款[1]。美国专利法第111条(b)款指出了与临时专利申请相关的一些条件，即建立申请日需要提供说明书和附图；维持申请日需要在规定的时间期限内提交申请费和发明人姓名。第119条(e)款指出临时专利申请(下文简称“临时专利”)为申请人确立了一个优先权，其保护期限是1年，在此期限和保护范围内，只有该“临时专利”的持有人可以提出有关专利申请。但是，专利申请案以临时申请的方式提出后，必须在1年内正式向美国专利商标局提交转换请求书，将“临时专利”转为正规申请，否则此“临时专利”在1年后自动失效。正规申请的内容应包含临时专利申请的内容和经改写后的内容。

临时专利申请规定所针对的对象主要是：已经脱离基础理论阶段，具有应用前景和潜在商业价值，但还不能申请专利的成果。如果一项成果的应用前景还不明朗，可以先申请临时专利，待进一步研究后再申请正式专利。对于药品而言，它可以有效地保护刚刚发现而尚未完全证明有效的药物分子或药靶[2]。

1．2　“临时专利”的实质相当于“国内优先权”

笔者认为，临时专利不是真正意义上的专利，临时专利不能予以审查，也无法授予专利权。实质上，它仅仅是为申请人在将申请转换为正规申请之前保留一个优先权日，相当于国内优先权，而这种较低成本的申请方式使得美国申请人与外国申请人享有乌拉圭回合谈判的同等权利。

2　美国“临时专利申请”规定与中国的“本国优先权”规定的比较

临时专利申请制度的本质相当于国内优先权。我国1992年修改后的《专利法》中第二十九条第二款对“本国优先权”作出了规定：申请人于1992年1月1日以后在中国第一次提出发明或者实用新型专利申请(包括药品和用化学方法获得的物质的专利申请以及食品、饮料和调味品的专利申请)之日起12个月内，又向专利局就相同主题提出专利申请的，可以享有优先权。此后，我国于2002年修订的《专利法实施细则》的第三十三条又对获得本国优先权的条件作出了具体规定：没有要求过外国优先权或者本国优先权，即说明本国优先权应是首次使用而且只能适用一次；还未被专利局授予专利；不属于按照规定提出的分案申请的。

由此可见，这两种规定的相同之处，除了上述获得本国优先权的条件外，对有效期的规定都是12个月，如果12个月内没有提出第二次申请，则“临时申请”或“在先申请”自动失效；此外，本国优先权的客体都被严格限制为发明和实用新型。

2．1　“临时专利”与“国内优先权”的积极意义

2．1．1　避免申请人在未获得专利权的同时遭遇技术秘密公开

根据美国专利法的规定，约有10％的专利申请可以作为特例在专利授权前不予公开，其他的在18个月之后公开；我国专利法规定，所有的专利申请自申请日起第18个月应予以公布。因此，通常情况下，如果专利申请人由于客观条件的限制而对其发明创造的“三性”缺乏正确的估价，那么很有可能因不能通过实质审查而无法获得专利授权，但其技术秘密却已经公开了。然而，如果申请人运用国内优先权制度，预先进行专利申请而取得申请日，然后，如果申请人能在12个月内通过进一步研究完善技术，达到专利授予的要求，则申请人可以要求优先权，以避免在此期间别人的公开影响到自己发明创造的专利性；如果申请人在12个月内没有达到这些要求，还可以撤回在先申请，避免对其技术的公开。

2．1．2　有利于保护申请人的利益，鼓励创新

何时提出专利申请最有利一直是人们关注的问题。过早申请专利，可能会由于一些技术问题尚未完全解决，难以通过专利的实质审查；过晚申请专利又担心他人占了先机。本国优先权规定较好地解决了这一矛盾。申请人可以在成果还不是完全成熟时先提出申请，达到尽早保护自己的发明构思与基本发明技术的目的，避免第三人在此期间抢注专利。在保留了一个较早的申请日之后，发明者有1年的时间来完善技术成果，在此期间还可以筹集实施该发明所需要的资金，必要时甚至还可以将成果市场化，以获取经济效益。

2．1．3　有利于促进发明人加快研究进程

由于本国优先权的期限是1年，这就在客观上要求发明人必须在第一次申请之后的1年内完成对相同主题的发明创造的完善工作。如果专利申请人既没有在1年之内完成相应工作，也没有采取更改专利保护方法的措施，那么就很可能因为高估了发明创造的价值，或者因他人在此期间对该项技术的公开行为而导致其无法获得专利权。正是在这种制度的激励下，发明者在第一次提出专利申请后，赶在本国优先权期限届满前完成技术完善的工作，从而间接加速发明创造的进程，推动科技的发展。

2．1．4　有利于减轻申请人的负担

中美两国专利法都规定专利的修改只能限定在原说明书记载的范围内，在申请之后所作的改进与完善，通常只能作为新的申请提出。但一项发明创造往往会形成两项前后关联的专利，即后一专利是前一专利的改进专利，而专利权人则要长期就同一发明创造支付两件专利费用。本国优先权允许申请人在1年的期限内将相同主题的发明创造进行完善，只发生一件专利费用，而且还允许将若干个临时专利合并为一件正规专利申请，这在减轻专利权人的经济负担的同时，也调动了其进行创新的积极性。

2．1．5　有利于提高专利申请的质量，加强专利保护

一般来说，首次申请专利时，就技术本身而言，发明者对成果的认识及其解决技术问题的方案等都有一定的局限性，背景技术资料也收集得不够全面；另一方面，为了赶时间，在

申请文件的撰写和保护范围及权利要求的确定上，可能会考虑不周。而通过要求国内优先权，申请人与人能够有较充足的时间对技术与专利保护的系列问题，甚至对市场上可能出现的相关问题，进行较深入的研究分析。在此基础上对第一次专利申请作出的修改、补充和完善，无论是从技术上还是从权利要求的层面来看，其专利的可靠性与稳定性，相对来讲都要好―些，一旦遇到侵权诉讼，胜诉的把握会更大一些。这对于加强专利的保护都是有利的。

2．2　美国临时专利申请的积极意义

2．2．1　申请方式更简易、快速

临时专利申请可以先提出一个简化的申请，这样使申请人以较低的初始投资，赢得1年时间去评估发明的商业潜力。因此它规定，临时专利申请不需撰写完整的详细说明书，不必办理完整的申请文件，递交申请时也只需满足最低的形式要求。美国专利商标局不对临时专利申请的价值进行评估，审批也比较简单，而且其申请费用也比正式专利申请少得多。临时专利申请只需要支付150美元，而正规申请申请费就是500美元，还不包括律师费、各种文书制作费用及权利要求等费用。我国《专利法实施细则》第三十二条规定，申请人要求优先权手续的，应当在书面声明中写明第一次提出专利申请(以下称在先申请)的申请日、申请号和受理该申请的国家；要求本国优先权的，申请人提交的在先申请文件副本应当由国务院专利行政部门制作。相对而言，我国的在先申请虽然较之于后一次申请的手续也相对简单，费用也相对低廉，但比起美国临时专利申请的规定来还是复杂了一些。

2．2．2　专利期限更长

美国专利法第154条(a)款中规定，依第119条内容规定的临时专利申请的优先权不计人专利权期限，也就是说1年的未决时间不包括在20年的专利保护期限内，该期限从正规专利申请递交之日起算。因此，临时申请给申请人提供了12个月的专利保护宽限期，其专利保护期限实际是21年。而我国《专利法实施细则》规定，专利法所称申请日，有优先权的，指优先权日。我国对专利的20年保护期是从专利申请日开始计算的，也即从优先权日算起，因此，专利保护期限是20年。

3　美国临时专利申请对我们的启示

3．1　我国制药企业应积极利用本国优先权制度，强化专利保护意识

上文已经提到国内优先权制度能充分保护申请人的利益，因此企业应该充分利用这一武器，尽早地为自己的研究成果申请专利保护，防止苦心研究的成果被别人抢占先机，“为他人做嫁衣裳”。

此外，我国的本国优先权制度也有较美国的临时专利申请制度更为灵活的地方，我国《专利法实施细则》第三十三条第二款中规定，申请人要求本国优先权，在先申请是发明专利申请的，可以就相同主题提出发明或者实用新型专利申请；在先申请是实用新型专利申请的，可以就相同主题提出实用新型或者发明专利申请。发明专利和实用新型各有利弊，申请人可以利用本国优先权更加灵活地选择对自己更有利的保护方法[3]。当申请人对其发明创造所具专利性程度把握不准确时，就可以利用此项规定将其发明创造先申请实用新型专利，待技术成熟后再申请发明专利；如果申请人先提交了发明专利申请，却发现该技术可能达不到发明专利的水平或者该产品的市场寿命不长，也可以在12个月内再递交实用新型专利申请，而申请日依然是第一次申请的时间。

3．2　我国制药企业应关注国外的专利制度

我国《专利法》第二十条规定，中国申请人要把在国内完成的发明创造向外国申请专利的，必须首先或同时向中国专利局申请专利，使得发明创造可以首先在我国得到利用。而美国专利法第111(b)(7)款规定申请人不能利用外国申请为他的临时申请建立优先权。否则外国申请人享受的是2年的宽限期，而首次提交临时专利申请的美国发明人则只有1年，有违国民待遇原则。因此，目前我国申请人申请外国专利只能通过巴黎公约或PCT途径。但我们完全可以通过关注美国的临时专利获取专利信息，把握专利动态，间接受益。

3．2．1　关注“临时专利”，避免侵权纠纷

企业在进行新药研发时，应对药品或化合物的专利状况有所了解，避免侵权纠纷的发生。我国《药品注册管理办法》第十一条也规定，药品注册的申请人应当对其申请注册的药物或者使用的处方、工艺、用途等，提供申请人或者他人在中国的专利及其权属状态的说明；他人在中国存在专利的，申请人应当提交对他人的专利不构成侵权的声明。由于申请“临时专利”的诸多优点，国外越来越多的企业或研发机构在“临时专利”申请的比例也越来越高。因此关注专利状况不能不关注“临时专利”，一旦发现本企业正在研发的某药物或化合物已经在国外申请了“临时专利”，企业在决策时就应慎重考虑进退问题，以免造成不必要的浪费。

3．2．2　关注“临时专利”，获取信息，促进仿创结合

从我国科研机构和制药企业的研发实力来看，目前要脱离仿制，实现完全自主创新是有一定困难的，但在仿制过程中产生创新技术，即“仿创结合”则是目前国家提倡的道路。实践证明，只有在仿制道路上勇于创新的企业才能在市场竞争中立于不败之地。企业通过技术创新实现经济效益突飞猛进的例子屡见不鲜。例如天津药业在1992年引进地塞米松工艺的基础上，通过1993年和1997年的先后两次重大技术突破，使地塞米松系列产品的成本先后降低了30％和40％，迫使跨国公司于1998年完全退出了垄断10年的中国市场。该企业的产品已占国内市场的80％，亚洲市场的45％[4]。我国企业可以通过关注国外的临时专利，获取最新的科研信息，

3．3．3　关注“临时专利”，及时把握专利动态

临时专利于正规专利之前提出，更具时效性。关注临时专利，可以及时把握专利动态，根据情况变化作出反应，以免陷入被动。例如2003年4月，当非典的阴云刚刚散去的时候，美国疾病控制与预防中心就申请了一项涉及非典的临时专利。这无疑对我国是一个巨大的冲击，针对这一情况，中科院上海生命科学研究院立即启动了防治非典新方法和新药物的研究工作，上海市知识产权局即布置专利检索人员收集国内外与非典相关的病因病源、抑制治疗、药物研究等方面的专利文献，不到10天时间就从“中外专利数据库”中筛选了有关抗冠状病毒、病毒抑制、核酸、核酶等方面的上万篇专利文献，其中最新的数据是2003年4月23日才公开的专利文献，有效地促进了我国在非典领域的研究成果居于世界领先水平。

总之，我国的专利制度要与国际接轨，必然要研究世界各国的专利制度，尤其是国外有所创新的制度，这对我国专利制度的完善有积极的借鉴意义。本文所述的美国临时专利申请规定，也希望能对我国的制药企业有所启示。

参考文献

1　程毓渡。如何把握知识产权与专利授权[N]．医药经济报，2005，9，37．