保护眼睛的途径汇总十篇

序论：好文章的创作是一个不断探索和完善的过程，我们为您推荐十篇保护眼睛的途径范例，希望它们能助您一臂之力，提升您的阅读品质，带来更深刻的阅读感受。

篇（1）

[中图分类号]G64[文献标识码]A[文章编号]1005-6432（2014）43-0163-02

1加强顶岗实习权益保护的意义

根据国务院《关于大力发展职业教育的决定》和教育部《关于全面提高高等职业教育教学质量的若干意见》的精神，要大力推行工学结合，突出实践能力培养，通过工学交替、顶岗实习、订单培养等人才培养模式来实现教学过程的实践性、开放性和职业性。因此，顶岗实习是行业、企业、学校优势互补和资源共享的客观要求，是实现教学过程与生产过程对接的需要。

顶岗实习是《国务院关于大力发展职业教育的决定》中的“2+1”教育模式，即学生在校学习时间为2年左右，最后1年在实习指导教师或企业师傅的具体指导和组织下，学生以技术、生产、服务或管理人员身份在特定的工作岗位上带薪生产。其包含两层含义：顶岗，即履行岗位的任务与职责，其劳动付出等同于企业工作者；实习，是指学生在实习单位通过实践学习专业技能。因此，顶岗实习的学生具有“学生”与“劳动者”双重身份。在实习工作中，他们承担了企业员工的任务与职责，但由于学生这层身份，并不受《劳动法》保护，而目前国家也没有专门的法律法规来保障高职院校学生实习期间的合法权益，更没有具体涉及学生在企业实习活动中的劳动保护、事故处理等问题的对策。高职院校学生顶岗实习权益能否得到有效保护，事关家庭、社会的和谐稳定，事关学校的持续健康发展。

2顶岗实习期间权益风险分析

21在危险环境中工作，生命安全受到威胁

顶岗实习学生虽是代替企业职工进行作业，但并不受《劳动法》保护。如果企业与学生均安全意识不强，且实习企业中确实存在容易造成安全危险的生产环境和设备，则进行顶岗实习的学生就很容易面临各种安全事故的威胁，而且缺乏法律保障，将面临无法依法获得救济的风险。

因此，为了保障实习学生的安全，维护学生顶岗权益，2007年教育部与财政部联合颁布了职教成4号文件《中等职业学校学生实习管理办法》，首次对实习学生提出“五个不准”：不准安排一年级学生到企业等单位顶岗实习；不准安排学生从事高空、井下、放射性、高毒、易燃易爆、国家规定的第四级体力劳动强度以及其他具有安全隐患的实习劳动；不准安排学生到酒吧、夜总会、歌厅、洗浴中心等营业性娱乐场所实习；不准安排学生每天顶岗实习超过8小时；不准通过中介机构组织、安排和管理实习工作。

22企业竞争激烈，休息时间被剥夺

随着经济的发展，企业竞争日趋激烈，企业为了生存发展，不得不使出浑身解数争夺市场，抢占商机。为了满足市场需求，各岗位工作量增加，导致企业随意安排加班劳动。《劳动法》规定一般加班时间每日不得超过1小时，特殊原因情况下每日不得超过3小时，且每月不得超过36小时。《中等职业学校学生实习管理办法》第五条明确规定，“不准安排学生每天顶岗实习超过8小时”。

23受学生身份限制，未能获得相应的劳动报酬

由于顶岗实习学生未能与企业签订就业合同，未明确劳动报酬，某些企业视学生为廉价劳动力，与其他劳动者不能同工同酬，甚至基本月收入远远低于当地最低生活保障工资等现象都在一定程度存在。《职业教育法》规定，“企业、事业组织应当给予上岗实习学生适当的劳动报酬”；《中等职业学校学生实习管理办法》第八条规定，“实习单位应向实习学生支付合理的实习报酬。学校和实习单位不得扣发或拖欠学生的实习报酬。”

24未能享受等同于企业员工的劳动保护及工伤保险权

由于顶岗实习学生的双重身份，仍为在校学生，不能签署就业合同，不受《劳动法》保护，某些企业在学生发生工伤后拒绝赔偿。《中等职业学校学生实习管理办法》第十二条规定“要为实习学生购买意外伤害保险等相关保险，具体事宜由学校和实习单位协商办理。实习期间学生人身伤害事故的赔偿，依据《学生伤害事故处理办法》和有关法律法规处理。”

3顶岗实习期间权益受侵害的原因

31缺乏专门的顶岗实习权益保障的法律制度，学生无法可依目前我国没有一部专门针对高职学生在顶岗实习期间权益保障方面的法律法规。我国《教育法》、《劳动法》、《劳动合同法》、《高等教育法》均没有规定任何顶岗实习内容。唯一一部涉及顶岗实习的国家法律《职业教育法》仅提到“国务院有关部门、县级以上地方各级人民政府以及举办职业学校、职业培训机构的组织、公民个人，应当加强职业教育生产实习基地的建设，企业、事业组织应当接纳职业学校和职业培训机构的学生和教师实习；对上岗实习的，应当给予适当的劳动报酬”，内容简略，操作性不强。

32企业、学校、学生签署的实习协议中，职责不明

在生产实习中，未明确划分企业、学校、学生应尽的权利、义务与责任。由于顶岗实习学生的双重身份，决定了在实习过程中应由学校、企业双方共同管理。如若学校和企业双方对权利与义务不明确，双方管理重合，会造成管理主体混乱；双方考虑若有空缺、漏项，则可能带来实习工作中的安全隐患。

33学生缺乏法律意识，自我维权意识不强

某调研机构针对高职院校学生顶岗实习权益保护等问题展开问卷调查，调查发现有半数以上的学生对法律赋予自己的权益知之甚少，仅有8%的学生知道《劳动法》规定每周劳动时间为40小时；有363%的学生会在自己的合法权益受到侵害时选择“离开”或“忍让”，他们认为维权的成本过高，不值得。有821%的学生每天工作时间超过8小时，476%的学生一个月中没有休息日，其中没有按规定支付工资的占总人数的395%。

4高职学生顶岗实习期间权益保护方法

41尽快建立专门的顶岗实习权益保障的法律制度

无法可依是目前高职院校学生顶岗实习期间维护自身权益的最大障碍。要建立专门的法律，通过国家强制性手段来规定企业与学校的责任，以保障顶岗实习学生的人身权、休息权、报酬权、劳动保护权、工伤保险权等合法权益不受侵害。

42学校方提前对实习企业进行危险源评估

在学生实习前，学校应提前去企业考察，对企业中较为危险的环境与设备进行危险评估，与企业协商将危险隐患尽量降低以达到可接受程度并拿出应对策略，或放弃该实习工作。

43与企业签订详细的实习协议，明确各方的权利、义务和责任目前，由于我国法律对顶岗实习权益保护的缺失，通过签署学校、企业、学生三方协议，来规范各方的权利、义务与责任。一旦发生劳务纠纷或工伤、安全等问题，可根据协议划分责任，采取民事诉讼来保护自己的相关权益。

44加强法制宣传，提高学生的维权意识

法律知识贫乏是维权意识淡薄的主要因素。学校需加强法制教育，开展法制活动，使学生在生活中接触到法律，鼓励其用法律解决问题，维护自身的合法权益。

45加强维权力量，建立校内维权机构

建立专门的维权部门，既可对校内学生宣传法律知识，加强其维权意识；又能对权益受到侵害的学生提供咨询服务；还能站在学校的立场拿出应急方案。

46完善医疗保险和意外伤害保险

顶岗实习学生由于身份受限，无法与企业签订劳动合同，劳动受伤无法按工伤保险条例进行补偿，只能通过购买商业保险来预防此类意外的发生，其费用可由学校、企业、学生商讨决定。

参考文献：

[1]乔宏哲高职学生顶岗实习权益保障风险分析及防范对策[J].黑河教育，2011

[2]徐志刚顶岗实习：学生权益存隐患教育与职业，2009（8）.

[3]郭永生浅析校企合作模式――顶岗实习[J].中国市场，2013（45）.

篇（2）

中图分类号：X24 文献标识码：A 文章编号：2095-624X（2017）01-0022-01

1.r值冲突

环境保护是属于公共物品的范畴，准确地说是属于非排他性但具备竞争性的公共物品，也就是人们常说的“公地悲剧”“公共池塘”。依目前的情形来看，环境保护正处在产品供给不足期间，即政府无法满足居民对环境质量的高需求。其原因在于公共产品的提供仅仅是对价值的选择、对利益偏好的选择，不能同时满足所有人的价值取向。这表明一部分人可以在价值上获得满足，而另一部分人则要作出价值牺牲。价值满足群体与价值牺牲群体所追求的价值目标是相互对立的、相冲突的。

从环境保护政策执行的价值视角出发分析公共政策的相关行为主体的价值冲突，可以更好地理解政策在执行过程中出现的扭曲和失误。

政策的顺利执行将反映决策者的价值取向，若所作出的价值选择只能满足大多数人的利益，在这个过程中价值利益得到满足和实现的则是价值满足群体，价值利益受到损害或未能实现自身利益的则是价值牺牲群体。但是在实际的政策执行过程中，价值满足群体有可能因为执行的扭曲而成为价值牺牲群体，未能从政策中受益。反之亦然。

2.个人利益―公众利益分析

在环保政策问题上，我们往往看到的政策执行是根据执行者的主观意愿使其达到他们所谓的价值最大化的。因为政府官员都有双重身份：作为有私人权利和个人利益的个体，作为公共权力的行使者代表公共利益[1]。公共权力的诱惑性特征使少数行政官员在政策执行过程中利用公共权力损害公共利益而谋取私利。

地方政府为了寻求更好的政绩，促进地区经济发展，广泛地招商引资，但是引资进来的企业往往是污染严重的或者是无法继续生产而被关闭的企业。

作为公共利益的一方希望能尽快降低污染，走循环经济的道路，促进社会的可持续发展；而有些地方官员则更多地从自身利益出发，追求短期的经济效益，鼓励继续发展生产。所以说，要使政策执行者在执行政策的过程中始终保持绝对的“价值中立”实际上是难以做到的。如果一项公共政策威胁到自身利益，那么执行者无论出于公心或者私心，都有可能抵制这一政策，因而就使得该项政策很难顺利有效地得到执行[2]。

3.成本―收益分析

从成本―收益分析来看，环境保护政策在执行过程中，地方政府能通过低耗能、低污染的燃料来生产产品、降低污染，但人们往往更看重在高污染环境下生产出的产品所获得的超过以低耗能方式生产出的收益，即使周围的一小部分人要忍受污染物的侵害。倘若每一个人都是利己者，那么将所有人产生的快乐（从产品中获得的收益）加起来，它会超过周围居民所受的痛苦。但是产品的实际收益的考量应该顾及因产品生产所导致的他人痛苦和遭遇，如水质污染。在现实中，收益却往往无法得到很好的衡量，这也是问题的关键所在。

4.分析公共政策执行的价值冲突的启示和意义

公共政策的执行不可能是一帆风顺的，即使所制定的公共政策近乎完美。公共政策执行过程中如何协调各方利益，促进正面价值的实现，规避负面价值，促使公共政策更加有效地执行，还有一段很长的路要走。和谐社会需要坚持科学发展观，走可持续发展的道路。所以，在环境保护问题上，我们应该追求绿色的GDP，走资源节约型、环境友好型的循环经济模式，并将其作为对政府官员政绩的考核内容；各级环保部门实行垂直管理，人事任免权交由上级环保机构，官员直接对其负责，赋予环保局更多的执法权力和执法力度；完善生态环境保护法规体系和管理体制，开展生态环境教育，鼓励公众参与环境保护，提高全民的环保意识；更重要的一点是将环境保护作为产业来开发，通过引用市场激励机制，对逐渐稀缺的资源征收适当的税收（对因环境污染所造成的损失征收一定的税收，以弥补他人的损失）；也可以将某地区的环境保护责任托付给某一个体或集体，并对其进行管理。这些都将有利于环境保护政策的有效实施，改变“污染能赚钱，不污染不能赚钱”的怪现象。

篇（3）

【摘要】在静态图像上嵌入数字水印可以公示所有权，数字水印可以在静态图像著作权被侵犯时作为纠纷中的证据。借鉴国外立法与实践，总结我国经验，应充分灵活运用数字水印技术，保护静态图像著作权，发挥其人文、艺术价值。

关键词 数字水印；静态图像；著作权保护

According to the static state picture work power of the numeral watermark protection research

Zhu Jin yi

【Abstract】Imbeding numeral watermark on the static state picture can Mr. show ownership， numeral watermark can at the static state picture work power drive infringe upon Be the proof in the dispute.Draw lessons from abroad lawmaking and practice， summary our country experience， should full use flexibly numeral watermark technique， protection the static state picture work power， exertive its humanities， art value.

【Key words】Numeral watermark;Static state picture;Work power protection

一、数字水印概况

（一、数字水印的概念

有学者认为在使用者对静态图像著作权者造成损害而感到困扰的时候，使用图像时也会对其真实性和完整性产生怀疑。作为保护多媒体信息真实性、完整性的传统加密技术存在缺陷，数字水印是作为加密技术的补充，在多媒体信息的著作权保护和完整性验证方面得到迅猛的发展。

数字水印是可以以一种不容易被人所觉察到的手段插入一个或多个秘密信息，来实现隐蔽传输、存储、标注、身份验证、著作权保护等目的，并且这种方法不会影响到原载体的使用，为数字数据权利人所享有的权利提供保护的一种技术手段。当一个作品的著作权或所有权发生冲突时，可以提取嵌入原载体的水印来验证其权威性。

（二、数字水印的特征

1、鲁棒性（稳健性：

是指一个数字水印应能承受大量的改动，包括恶意处理和常规处理。恶意处理包括：慕改、伪造、 去除水印等。常规处理是指数字水印经过载体图像的某种改动后，如经过JPEG压缩、滤波、扫描与复印、剪切、打印、图像增强、二次抽样、噪声污染、二次t化A/D.D/A转换或几何变换和几何失真（如平移旋转、尺度拉伸等等操作， 图像视觉效果保持不变且仍能被提取出或证明其的存在。

2、安全性：

是指水印信息嵌入后随机分布于图像中，因其位置较隐蔽，能够抵抗一些非法拦截和破解而使水印不被破坏、删除或者窃取。

3、透明性（隐藏性：

是指加入水印的图像和原始图像基本上相同，载体图像没有明显的降低质量的现象，且嵌入水印的数据经过隐藏处理在视觉或听觉上不可感知。

4、通用性：

因水印信息嵌入于数据而非文件本身，好的水印算法适用于多种文件格式和媒体格式，即使文件格式变换，相关水印的数据也不易丢失，通用性在某种程度上意味着易用性。

二、基于数字水印技术的静态图像著作权保护的可行性

（一、静态图像著作权保护的重要性

生活中，商家会设计独特的有个性的商标来代表自己的企业、公司等，而且最常用的就是用平面广告来宣传商品和活动。这种以静态图像为表现方法不仅清晰明了，而且可以通过巧妙的设计留给人们长久的印象，以及扩大产品的销售量。平面设计、广告设计公司或者工作室也数不胜数。而随之当人们创新思维精神减弱、自主创新能力减退，对于设计较好的静态图像，就会非法使用、篡改该作品，甚至有以自己的名义进行发表公开发行的侵权行为的产生。

于是，当对于以静态图像为主要形式的作品的需求日益扩大，静态图像著作权保护的重要性日益凸显。

（二保护其著作权的静态图像

根据《中华人民共和国著作权法》，该法所称的作品主要包括以下9项：（1文字作品；（2口述作品；（3音乐、戏剧、曲艺、舞蹈、杂技艺术作品；（4美术、建筑作品；（5摄影作品；（6电影作品和以类似摄制电影的方法创作的作品；（7工程设计图、产品设计图、地图、示意图等图形作品和模型作品；（8计算机软件；（9法律、行政法规规定的其他作品。其中美术、建筑作品，摄影作品，工程设计图、产品设计图、地图、示意图等图形作品和模型作品等可以归为静态图像的范畴。可见静态图像占著作权法保护的客体比例较大。

（三静态图像著作权保护的权利主体

静态图像的权利主体，是静态图像专有权利益的承担者。通常来说成为权利主体必须具备两个条件：一是有独立的人格，二是经法律确认。对于静态图像的权利主体的确认多数情况下并不困难。但是如果当以下情况发生的时候，笔者认为应当将嵌入数字水印认为即是登记的形式，具有对抗效力：

某甲发表静态图像，并嵌有宣示自己为该静态图像所有权人或者著作权人的水印，而当乙发现时宣称自己才为该静态图像著作权人，与甲产生知识产权纠纷。

对于该种情况的发生，如果乙没有足够的证据证明自己为著作权人，则应当根据嵌入数字水印的时间的迟早判断，认为嵌入数字水印相当于登记，具有创设和公式效力，判断甲为该静态图像的著作权人。

（四静态图像著作权保护的权利内容

静态图像著作权保护的权利内容也就是静态图像的权利主体应当享有的权利种类，按传统著作权理论可以分为精神权利和经济权利。

1、精神权利

静态图像是一种以简单形式来表现的智力成果。静态图像著作权人可以通过该种表现形式来表现自己的设计，或者通过画面来表现抒发自己的情感。静态图像著作权人有权公开，有权要求对复制其作品的一方承认其系静态图像的著作权人。

2、经济权利

权利人有权通过他人对其作品的利用获得经济报酬。所以静态图像著作权人可以通过自己对其拥有的著作权，利用其进行收益。比如平面广告设计人可以通过为商家设计产品的平面广告来收取经济报酬，再由宣传商利用其作品进行产品宣传。经济权的权利内容可以分为复制权、发行权、摄制权、播放权、展览权等。其中静态图像权利主体主要通过复制权、展览权获取经济利益。

（五静态图像著作权纠纷案例分析及思考

在网络环境中的真实纠纷案例少见，多数在现实生活中发生纠纷。下列为案例举例：

丁长禄是张家口市群艺馆离休干部、中国摄影家协会河北分会会员，今年已73岁。2000年1月初，丁长禄在购买由张家口市人民政府、张家口市函件广告局设计、制作、销售及国家邮政局发行的2000年贺年（有奖明信片时发现，有一题为“中国张家口”的装帧图案，其主体画面是盗用自己拍摄的展现张家口代表景观“大境门”的景物照片《大好河山》。丁长禄认为，他作为《大好河山》作品的作者，依法对作品享有著作权，三被告未经许可，以赢利为目的，不署名使用作品，并对作品进行剪裁和添附，破坏了作品原有的完整性，故起诉到法院。法院经审理认为：摄影作品《大好河山》的作者是丁长禄，他对这一摄影作品享有著作权；张家口市人民政府是《中国张家口》2000年贺年（有奖明信片的设计者，因该明信片内容所产生的民事责任应由张家口市人民政府承担；张家口市人民政府在未经丁长禄许可的情况下，对这一摄影作品进行修改及未给丁长禄署名的行为，侵犯了丁长禄对这一摄影作品所享有的修改权和署名权，应承担相应的民事责任；国家邮政局作为2000年贺年（有奖明信片的发行者，并且在该明信片上也注明了“国家邮政局发行”，因此，国家邮政局应对明信片所涉及的著作权问题与张家口市人民政府共同承担民事责任。法院依据《中华人民共和国著作权法》的相关规定，做出上述判决。

通过此案可以再次验证静态图像因为形式简单，容易被模仿、抄袭，可以通过技术手段再加以剪接、添加等篡改，而且又是因为其形式简单，对于现实生活中静态图像著作权发生的纠纷较难进行解决。

三、国际基于数字水印的静态图像著作权保护的立法及启示

不管发达国家还是发展中国家，经常会有对静态图像的使用，也不论其数字环境发展如何，在一定程度上，静态图像的著作权面临着挑战。对此，不少国家和组织做出过尝试，针对数字环境下的知识产权执法出台相应法律法规。在此我们主要讨论国际在静态图像著作权保护上的立法及对我们的启示。

在国际角度上，涉及著作权保护的公约主要有《反假冒贸易协议》（ACTA、《伯尔尼保护文学和艺术作品公约》（Berne Convention for the protection of Literary and Artistic works、《世界知识产权组织表演和录音制品条约》（WIPO Performances and Phonograms Treaty等。

（一《反假冒贸易协议》与运用数字水印以期保护权利管理电子信息

《反假冒贸易协议》作为最新的知识产权执法国际标准，其核心内容第二章与《TRIPS协定》规定的知识产权执法大同小异，而最大的区别就在于ACTA规定了有关数字环境下的知识产权执法。在这里主要讨论其规定的关于权利管理电子信息的义务方面的内容。

“权利管理信息”是指附着在作品、表演、录音制品的复制品上的信息，或作品表演、录音制品在向公众进行传播或者提供时所出现的信息，包括：1.识别作品、表演、录音制品、作者、表演者、录音制品制作者以及在作品、表演和录音制品中的所有权利人的信息；2.有关作品、表演、录音制品的使用的条款与条件的信息；3.代表上述信息的任何数字或代码。并且在ACTA第27条第7款规定：“为了保护权利管理电子信息，缔约方应规定充分和有效的法律救济办法，制止任何人明知或就民事救济而言应知其行为会诱使、促成、便利或掩盖对任何版权或邻接权的侵害，却未经授权而实施下列行为：（I去除或改变任何权利管理电子信息；（Ⅱ明知权利管理电子信息未经许可已被去除或改变，却发行、为发行目的而进口、广播、向公众传播或提供作品、表演、录音制品的复制件。”

通过ACTA的相关规定，可以看出权利管理信息是提供作品的权利人等相关信息，保护好权利管理电子信息在一定程度上等于保护好作品的著作权。而且在第27条第7款也规定了为了保护权利管理电子信息，缔约方应规定充分和有效的法律救济办法。对于本文静态图像著作权侵权的救济办法，数字水印是绝佳首选。数字水印既可以在作品中表现作品的著作权人等相关信息，又可以通过其鲁棒性等特点，保护其权利管理电子信息。

（二《伯尔尼保护文学和艺术作品公约》与静态图像难以保护的原因分析

伯尔尼公约是世界上第一个国际版权公约，原始签字国就有10国，是国家注重版权的国际保护的体现。

《伯尔尼公约》保护的作品范围是缔约国国民的或在缔约国内首次发表的一切文学艺术作品。其中“文学艺术作品”有图书、讲课、演讲、讲道、戏剧、哑剧、舞蹈、乐曲、电影作品、图画、建筑、雕塑、摄影作品，实用艺术品，地理学、解剖学、建筑学或科学方面的图表、图示及立体作品等。其次还包括“演绎作品”，即翻译、改编、乐曲整理，以某一文学或艺术作品的其他改造，只要不损害原作的著作权，这种改造就得到与原作同等的保护。图书、图画、图标、图示等静态图像包含其中，公约既保护经济权利也保护精神权利。

《伯尔尼公约》中有规定关于平面设计的保护，可见对于平面设计等静态图像的著作权保护开始上心。“在遵守本公约第七条第四款之规定的前提下，本同盟各成员国得通过国内立法规定其法律在何种程度上适用于实用艺术作品以及工业品平面和立体设计，以及此种作品和平面与立体设计受保护的条件。在起源国仅仅作为平面与立体设计受到保护的作品，在本同盟其他成员国只享受各该国给予平面和立体设计的那种专门保护；但如在该国并不给予这种专门保护，则这些作品将作为艺术作品得到保护。”

通过解读，可以发现《伯尔尼公约》中，静态图像的保护并不注重，《伯尔尼公约》着重在于文学作品和音乐作品等上面，规定了有关文学作品和艺术作品专有权利和各国对其的保护措施。根据公约第七条的叙述，如果同盟的成员国对实用艺术作品平面设计和工业品平面设计没有专门的保护，将作为艺术作品予以保护。而定性为艺术作品的话，在《伯尔尼公约》中的范围稍稍广泛了些，没有较好的对应的规定，不如文学作品和音乐作品保护规定全面。可见作为当代社会用处较多的可以呈现各种形式作品与设计想法的静态图像，其著作权在《伯尔尼公约》中不能得到全方位的保护。第一，从主体来看，静态图像的形式简单，在数字环境中仅仅只有JPG、BMP等格式，容量小、储存简单，在现实中可能也只是一张纸的份量，不如其他作品的表现时所需步骤复杂。第二，静态图像其著作权认证困难，创造一份以静态图像为表现形式的作品所需要的时间较少，并且静态图像容易复制，以至于在知识产权纠纷中，静态图像的著作权很难确定。第三，公约的规定有一定程度上的口号的意味，没有很多地对保护作品著作权的相关机构的职责与职能的规定，也就限制了对以静态图像为表现方式的作品的著作权保护水平。

（三《世界知识产权组织表演和录音制品条约》与静态图像著作权人精神权利

该条约制定所保护的客体是表演和录音制品，但是其中的条款对于静态图像的保护有很好的示范和借鉴作用。

篇（4）

这次，我和动植物专家陈庆一起前往临沧市，在当地向导的带领下，深入保护区的核心区域，希望通过亲身考察，了解目前保护区的森林资源基本状况，同时还希望通过红外相机，拍摄到一些珍稀动物的影像。

1 路边小饭馆的新奇食材

路边有家小饭馆，看上去有些简陋，但菜肴所用食材很新奇，像“独角仙”、“地雷蜂”等名字有些吓人的昆虫，在这里都成了美食。

天蒙蒙亮，我们乘车从昆明出发前往临沧市。半个月前，我曾随绿色和平组织去过那里，调查天然林遭破坏的状况，那是我第一次去到南滚河保护区南侧，根据对海拔、地势和林木的生长方向的分析，我判定在南滚河流域内，有一片保存较好的原始森林。

陈庆是动植物专家，他在路上没有丝毫疲倦，总是拿着手机朝车窗外拍照。出发前，我的慢性咽炎就发作了，一路上咳嗽不止，只能不停地喝水来缓解喉咙的痒痛。到吃午饭时，汽车停在了一个三叉路口，边上有家小饭馆，看上去有些简陋，但菜肴所用食材很新奇，像“独角仙”、“地雷蜂”等名字有些吓人的昆虫，在这里都成了美食。看到饭店老板养了蜂，陈庆便从蜂巢里捏出一只刚羽化的幼虫，对我说：“吃了它，咳嗽会好点。”我接过这只肉白色的幼虫，放在嘴里轻轻一嚼，一股浓郁的苦涩味瞬间充满了口腔，一连吃了几只后，我的嗓子果然舒服了很多。饭店老板见状，让我喝了一杯用树叶泡的茶，并说：“你吃得太多了，喝杯这种茶水，不然一会胃会疼。”陈庆入乡随俗，点了一份竹鼠辣椒饭，而我还是只吃了一碗泡面。

下午6点，我们到达目的地，与当地向导阿荣汇合。阿荣只有19岁，但陈庆看到他走路的样子，就对我说他是走山路的好手。吃晚饭时，阿荣要了一瓶白酒，他边喝酒边给我们介绍了保护区的基本情况，他说：“南滚河自然保护区在全国知名度不高，外界对其了解很少，但在保护区的核心区有许多珍贵动物，正是这个原因，现在深入核心区偷猎的人日益增多，不少野生动物不得不离开核心区，开始向游荡……”此后他还特意叮嘱我们说：“早在上世纪50年代末，山里的林子就开始遭到砍伐，现在不少地方的山是光秃秃的，我们不要往南走得太深，在那边遇到当地猎人会很麻烦，他们当中很多人都是无业人员……”我明白，阿荣是担心我们被抢劫。

2 营地突遇眼镜王蛇

那条眼镜王蛇不停地吐着信子，发出令人寒颤的“咝咝”声。此时，一人一蛇就像两个正在的武士，眼睛直直地盯着对方，谁也不敢转移视线。

第二天清晨，我们整理好物资和设备，在当地背夫的帮助下，向保护区出发。我们沿着泥泞的山路艰难地走了几小时，到达山溪边的一处空地，商量后决定将这里作为本次考察的大本营，背夫卸掉物资和设备后，我们就开始收拾各自的行李。就在砍伐竹子来支撑防水布的时候，陈庆突然惊呼起来：“眼镜王蛇！”我回头看去，只见陈庆拿起身边砍下的竹竿，迅速摆出防御姿势，眼镜王蛇受到惊扰，也立马竖立起脖子，口中不停地吐着蛇信子，发出令人寒颤的“咝咝”声。此时，一人一蛇就像两个决斗的武士，眼睛直直地盯着对方，谁也不敢转移视线。我在一旁兴奋地喊道：“阿荣，能不能抓住它！”他却回答道：“你不知道，这种毒蛇杀了我们这里的多少猎人。”我本来还着迷于这种世界上最大的毒蛇，但听到阿荣这么一说，也只得放弃了近距离拍摄的念头――我很清楚，万一被毒蛇咬到，其毒液会让我在短短一分钟之内昏迷，如果不及时救治就会危及生命。

此时，陈庆用竹竿控制住了他与蛇的距离，而那条眼镜王蛇直立的身子，几乎和陈庆的胯骨一样高，并不停地张嘴恐吓，随时准备攻击。根据经验判断，眼镜王蛇在张大嘴巴时，并不想真正进攻，或许是我们在砍竹子时，不小心误入了它的巢穴，而它只想吓走我们，如果我们现在将其赶走，它很有可能还会回来，因为它的老巢就在这附近。因此继续在这里扎营已不是明智之举，但此时背夫已经下山，我们无法临时更换营地。正当我们不知如何是好，阿荣说：“只要我们晚上将火生起，蛇自然就会搬家。”僵持了几分钟后，那条眼镜王蛇看我们没有离开的意思，终于掉头朝山溪对面游过去，当它的身子全部暴露在外时，我们目测到其体长竟超过3米！

搭好营地，阿荣独自去挖竹笋，我和陈庆则到对面山坡上去安放红外相机。突然，丛林深处传来一声好像石头落水的声音，陈庆警觉地说：“不对，这是猎枪的声音。”据我的朋友讲，他此前在保护区调查食肉动物时，就有安装在树上的红外线相机被猎人用枪打烂。这里的猎人通常以灵猫类和偶蹄类动物为狩猎对象，灵猫类动物主要生活在长有大片果树的区域，而像野猪、黄麂这样的偶蹄类动物，则大多出现在盐碱地周边，因此果树区和盐碱地都是猎人活动频繁的区域，我们决定避开这两类区域，谨慎选择安放位置。

在野外安放红外相机，除了要避免人为破坏，还需注意很多小细节。最令人头痛的是――昆虫能通过遗留在相机表面的汗液嗅到盐分，发现安装的相机。如果蛾子的翅膀挡住了接收器，就会导致相机不停地拍摄，严重损耗电量，影响其正常工作。因此在安装结束后，我们还专门用棉花蘸上清水，将相机仔细地擦拭了一遍，清洗掉遗留盐分，避免昆虫前来捣乱。

3 盐碱地蹲点拍摄

不知过了多久，正当我用手扯下一只爬到脸上的蚂蟥时，盐碱地对面的林子里有了动静，阿荣用手势朝我暗示：有什么动物来了……

第三天早晨醒来时，我觉得脖子后面有些僵硬，睡袋好像紧紧地粘在了皮肤上。我伸手一摸，手上就沾满了鲜血，瞬间便反应了过来：脖子里肯定钻进了蚂蟥。我迅速起身翻开睡袋，只见一只吸饱了我血液的蚂蝗，身体膨胀得硕大，吸盘上正往外滴血，我捡起蚂蝗扔进了火堆，处理伤口。

今天，阿荣要带我们去一片距离营地大约8公里的盐碱地，到那里蹲守拍摄偶蹄类动物。早饭吃了几块腊肉，我们便沿着泥泞小路出发，树叶在头上掠过，时时有蚂蝗掉落在身上，每走50米左右，我们就要停下来检查，把掉在身上的蚂蟥弹开。

突然，前方林子里传来一阵隐约的交谈声，阿荣用当地话大喊了一声，林子里很快走出来两个人，他们一人肩上扛着自制的猎枪，一人手上拎着一只还在滴血的动物，这两人是阿荣的朋友，相互打了招呼后便聊了起来。那人告诉我们，他拎的是一只小赤麂，保护区周边山里的猎人很多，有时还有从缅甸那边过来的猎人，他们都想抓最值钱的动物，打到其他不值钱的，要么自己吃，要么拿到集市上换点酒钱。

同猎人告别后，我们继续前行，一小时后到达盐碱地。雨林中，许多动物会经常前往盐碱地，通过啃噬盐碱地中的泥土来补充身体所需的盐分。这块盐碱地大小与篮球场相近，里面除了留有猎人杂乱的脚印外，还有一些水鹿和野猪来过的痕迹。我们拿着相机隐蔽在树丛中，静静地等待动物的光顾。

不知过了多久，正当我用手扯下一只爬到脸上的蚂蟥时，盐碱地对面的林子里有了动静，阿荣用手势朝我暗示，意思是来了一群山鸡，叫我准备好拍摄，当领头的山鸡谨慎地走向盐碱地中央时，我才看清那其实是一群白鹇。曾几何时，白鹇是极其普通的鸟类，在我国很多地方都能见到，但由于生态环境的恶化和人类的大肆捕杀，如今已很少见到其身影。在接下来的时间，我们只拍到了一些常见的动物，并没有特别的收获。回营地的路上，我在一棵树上看到几道陈年爪印，阿荣告诉我：“这些都是虎、豹等大型动物，为了标识自己的领地范围而留下来的。”

陈庆取回在野外安放了数天的红外相机，连接上电脑打开照片，看到果子狸、豪猪等白天不易见到的小型动物都被拍到，这比我们在盐碱地蹲点拍摄收获大多了。傍晚聊天时，我问阿荣：“现在这个地方还有老虎吗？”他肯定地回答道：“我保证没有，我们这边的猎人已经很久没见过老虎留下的踪迹了。如果想见到老虎，就必须冒险前往缅甸，甚至从缅甸再往西才能看到。”刚说到此，阿荣忽然望着距离营地不足50米远的一棵树，他拿起手电照射过去，兴奋地说：“是椰子猫。”

4 保护区现状令人堪忧

大型猫科动物对生存环境的要求非常苛刻，它们不仅要有足够的食物来源，还要有大面积的栖息地。

我们在调查时发现：在保护区内，动植物之间建立起了紧密的生态关系：小型动物以丛林中的成熟果实为生，并通过排便传播种子，与之保持共生关系。而生活在地面上的豹猫、猪獾等食腐性动物主要吃动物腐肉，这样能抑制森林疾病的传播，保证保护区内生态系统的良性循环。同时，大型食肉动物生活在食物链的顶端，它们捕杀小型动物，控制其数量，保证保护区生态系统的正常运转，并维持其生态平衡。如今，长期偷猎导致野生动物逐渐减少，同时，人类对森林的破坏让动物失去了栖息地，保护区内的生态系统正在慢慢失去平衡。

篇（5）

超分子化合物是微观单元以非共价键弱相互作用力结合而成的有序缔合体 [1-2]。超分子化合物具有识别、记忆、变换和传输等功能，因此在药物、光化学分子器件、膜材料[3-5]等方面应用广泛。其中药物包合物是超分子研究内容的独特领域，研究药物包合体系中分子间的相互作用机制，可为进一步深入理解包合物的理化性质、主客体包合反应机制以及包合物选择性结合受体的识别机制提供依据，药物包合物已成为当前超分子领域研究的热点。

脱氧土大黄苷（DES，结构式见图1）主要来源于天山大黄的蓼科植物，为二苯乙烯衍生物，属于茋苷。DES在抗肿瘤、抗氧化、降低II型糖尿病的血糖及提高机体免疫力等方面有显著疗效。但DES的水溶性极差，极大限制了该药物在制剂上的开发应用。如将其制备成超分子包合物，可增加水溶性、提高稳定性，达到改善药物生物利用度的目的。而制备具有实用价值的DES包合物，选择一种理想的药物包合载体材料为关键之一。

β-环糊精（β-CD，结构式见图1）在环糊精种类中应用最广[6-8]。适宜的空腔大小使β-CD成为近年发展起来的新型药物包合材料。β-CD以疏水性空隙经范德华力及非传统疏水作用力容纳或插入药物分子，形成的药物包合物又称“分子胶囊”，可不同程度改善药物溶解性，降低外在条件对药物分子的影响，提高药物的稳定性。目前已有大量有关环糊精包合药物的报道[9-13] ，但对药物包合物理论、包合物的结构分析等还有待开展深入的研究。

本研究选择DES为客体，含有7个葡萄糖分子的β-CD为载体，合成包合物并进行分析鉴定[14-29]，确定包合比、计算理论参数，为该类药物超分子包合物的研究奠定前期基础。目前，β-CD-DES包合体系的研究未见文献报道。

1 材料

F-4500型荧光光度计（Hitachi，日本）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（Shimadzu，日本）；DZF-6020型真空恒温干燥箱（上海林频实验设备有限公司）；PS-1000型磁力搅拌恒温水浴槽（Eleya，日本）。

脱氧土大黄苷（≥96%，赛纳斯特化学）；β-CD（≥96%，上海阿拉丁试剂公司）；无水乙醇（≥99.7%，天津市永大化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。试验用水均为二次蒸馏水。

2 包合物的制备及表征

2.1 β-CD-DES包合物的制备 DES 0.02 g 溶于50%乙醇，β-CD 0.5 g溶于60 ℃二次蒸馏水。将DES溶液缓慢滴入β-CD溶液中，60 ℃回流并搅拌反应2 h。反应液冷却至室温后过滤，沉淀用乙醇、蒸馏水洗涤数次，100 ℃恒温干燥5 h。

2.2 标准曲线的绘制 50%乙醇配制DES对照液 （20～50 mg·L-1），紫外扫描并在λmax 300 nm波长处读取其吸光度，绘制DES的浓度（c）～吸光度（A）标准曲线，数据拟合获得标准曲线的线性回归方程。β-CD在200～400 nm无紫外吸收，对DES的紫外-可见吸收光谱无干扰。测定β-CD-DES包合物体系的吸光度，利用DES的标准曲线计算游离DES的浓度，进而计算包结比等参数。

2.3 荧光光谱表征 荧光光谱仪在λex 260 nm，λem500～600 nm分别测定1.2×104mg·L-1的β-CD，DES，β-CD-DES （物理混合）和β-CD-DES包合物体系的荧光发射谱，比较分析光谱特征获得β-CD-DES包合物体系的荧光表征谱。

2.4 包合物的包合率测定 定量包合物溶于50%乙醇，在最大吸收波长处测其紫外吸光度，由标准曲线的线性回归方程计算DES的浓度，代入公式（1）计算包合率。

2.5 包合反应包结比及热力学函数的测定 分别配制30，60，90，120，150 mg·L-1 β-CD对照液，测其荧光光谱，按Hildebrand-Benesi方程以1/（F-F0）对1/[β-CD]n作图，求算包结比及反应热力学函数。

3 结果与讨论

3.1 DES与β-CD 的包合过程 β-CD包合DES反应方程式见图2。

β-CD分子略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，使得环糊精具有外亲水内疏水的特性，这种特性使得环糊精能够包合各种形状大小与环糊精内腔相匹配的疏水性客体分子，以此提高客体分子的溶解性及稳定性。

3.2 标准曲线 对DES对照溶液在300 nm波长处的吸光度进行测定，数据拟合获得线性回归方程为c=0.051 3+0.003 5A（r=0.995 2，SD=0.004 1， n=7， P

3.3 荧光光谱分析 DES，β-CD-DES包合物，β-CD-DES （物理混合）和β-CD的荧光发射谱见图3。DES形成β-CD-DES包合物后出现明显的荧光猝灭现象，表明DES分子嵌入β-CD的环状圆筒结构中，溶液中游离态DES浓度降低，导致荧光强度降低。而β-CD-DES（物理混合）只是简单的2种化合物物理混合，与β-CD荧光谱图几乎没有差别，这是因为溶液中含有过量β-CD和微量DES，所以混合物的荧光强度主要以游离β-CD的荧光强度表现出来，表明物理混合中药物未被环糊精包合。

图3为固定激发波长条件下，体系的发射荧光强度与扫描发射波长关系的二维荧光光谱图。客观上体系的荧光强度与激发波长、发射波长均有关系，应该是一种三维函数谱，即三维荧光光谱更能详细描述药物包合物体系的结构特征变化。β-CD，DES，β-CD-DES （物理混合）和β-CD-DES包合物的三维荧光谱见图4。

从图4可见，β-CD与DES的3D荧光谱各有其特征，β-CD的荧光发射谱中出现多个指纹峰，但强度明显弱于DES的3D指纹峰。β-CD-DES（物理混合）包含了完整的DES特征指纹峰，说明β-CD与药物DES的物理混合没有引起药物的任何改变，即没有形成有效包合物。β-CD-DES包合物中保留了β-CD的特征指纹峰，DES的特征指纹峰发生明显变化。其中，图4（B）图中的峰4未出现在图4（D）中，峰5发射波长蓝移了7 nm，且荧光强度减弱，表明分子间作用力形成的复合物改变了药物体系的空间结构。由此判断成功合成包合物，这与二维荧光法测得的结果相符。

3.4 包合物的包合率 包合物颗粒细小，颜色介于β-CD和DES之间。将测得包合物的吸光度代入标准曲线方程式，进而由公式（1）求得包合物的包合率为38%。

3.5 DES与β-CD的包结比及结合常数 结合常数是衡量主体β-CD与客体药物包结能力的大小，可以表征包合物的稳定性及包合反应的难易程度。在主体浓度大于客体浓度条件下，可采用Hildebrand-Benesi公式（2）获得包合物的结合常数。

式中，F为不同浓度β-CD的荧光强度；F0为客体DES荧光强度；F∞为包合物的荧光强度。将试验数据按1/（F-F0）对1/[β-CD]n （n=1，2，3……）作图，由直线的截距与斜率可求得结合常数K。

根据公式（2）做试验数据拟合图，n取值1～5。从拟合结果看，当n=2时，1/（F-F0）对1/[β-CD]2作图效果最优，获得良好的线性关系，说明主客体间形成2∶1的包合物，1/（F-F0）对1/[β-CD]2的关系见图5。

从图5可见，不同温度条件下，1/（F-F0）～1/[β-CD]2的线性关系良好（r>0.990 0），线性回归方程见表1，说明β-CD-DES包合物的包结比为2∶1。包合物的结合常数见公式（3）。

式中，[DES]为被包合药物的平衡浓度；[β-CD]为溶液中环糊精的平衡浓度；[β-CD-DES]为包合物的平衡浓度。计算不同温度条件下[β-CD-DES]包合物的结合常数，结果见表1。

由表1可见，求得的结合常数较大，且随温度升高而增大，说明β-CD包合DES生成稳定复合物。

3.6 DES与β-CD包合反应热力学函数 根据热力学公式ΔG0=ΔH-TΔS0，ΔG0=-RTlnK结合van′t Hoff公式，由结合常数的对数值lnK对温度的倒数1/T作图，可得出不同温度下的热力学函数，结果见表2。van′t Hoff公式见下。

由表2可知，吉布斯自由能G0

3.7 包合物的偏振度及各向异性 偏振荧光是荧光分子在偏振光激发下发射光发生变化的偏振光谱。通常用偏振度P和各向异性r表示。

式中G为校正因子（G=IHV /IHH），IHV和IHH分别为水平偏振光激发下的垂直偏振发射光强度和水平偏振发射光强度，IVV和IVH分别为垂直偏振光激发下的垂直偏振的发射光强度和水平的发射光强度，P和r的计算结果见表3。

荧光体的转动速度与偏振度P成正比，偏振度越小，荧光体转动速度越快。由表3可见，β-CD-DES（物理混合）的偏振度P及各向异性r与β-CD相比，几乎没有发生改变。而β-CD-DES包合物的P及r较β-CD均有较为明显的提高（分别提高了0.030，0.042）。说明β-CD-DES包合物由于药物嵌入环糊精空腔内，分子间相互作用使超分子体系稳定性增强，复合物体积变大，荧光体转动速度变缓，体系黏度增大而使偏振度增大。偏振荧光法定量证明了β-CD-DES包合物的形成。

3.8 DES与β-CD包结物的结构推测 研究证明分子结构是药物与β-CD相互作用的重要因素。DES具有2个疏水苯环，虽然分子的空间位阻不大，但要完整的包合药物小分子，客体分子所需的空间会超出单个环糊精分子的容纳空腔。由Hilde- brand-Benesi方程，1/（F-F0）对1/[β-CD]2呈现良好的线性关系，得出主客体包结比为2∶1，推测包结过程见图6，可能的结合形式有4种。

β-CD分子的小口端由7个伯羟基组成，大口端由葡萄糖单元2，3位的14个仲羟基组成。由于氢键作用环糊精分子排列成“笼状”或“管状”，客体分子被包埋其中，可能有以下4种不同构型：脱氧土大黄苷分子大头（含葡萄糖基与酚羟基）插入β-CD的小口端，小头（含甲氧基苯环）插入β-CD的大口端（图6A）；脱氧土大黄苷分子大头插入β-CD的大口端，小头插入β-CD的小口端（图6B）；脱氧土大黄苷分子大头插入β-CD的大口端，小头插入β-CD的小口端（图6C）；脱氧土大黄苷分子大头插入β-CD的小口端，小头插入β-CD的小口端（图6D）。

4 结论

本试验成功制备脱氧土大黄苷-β-环糊精包合物，通过光谱试验结合理论计算方法对包合物超分子体系进行深入探讨，得到包合物热力学函数及主客体包结比，氢键、范德华力为β-CD-DES包合物主要驱动力。试验数据说明，包合反应自发进行，包合物形成后体系的能量降低，生成稳定包合物超分子体系，药物的热稳定性及溶解性能均有明显提高，达到了预期效果。

另外，结合药物及载体空间构型，本研究推测出β-CD包合DES的4种类型，理论分析了包合反应的可行性。由于本实验室的量子化学计算资源有限，包合物的稳定构型有待进一步深入研究，但已开展的研究工作对环糊精-药物包合物体系中分子间相互作用作了一定程度的探讨，可为脱氧土大黄苷在医药方面的应用提供有关参考。

[参考文献]

[1] Steed J U， Atwood J L. 超分子化学[M]. 北京： 化学工业出版社， 2006.

[2] 麦松威. 高等无机结构化学[M]. 北京： 北京大学出版社， 2001.

[3] Dana A U， Kat J P， Luc B. Combining supramolecular chemistry with biology[J]. Chem Soc Rev， 2010（39）： 2817.

[4] Chen C F. Novel triptycene-derived hosts： synthesis and their applications in supramolecular chemistry[J]. Chem Commun， 2011（47）： 1674.

[5] Li Y， Park T， Quansah J K， et al. Synthesis of a redox-responsive quadruple hydrogen-bonding unit for applications in supramolecular chemistry[J]. J Am Chem Soc， 2011， 133（43）：17118.

[6] Volobuef C， Moraes C M， Numes S， et al. Sufentanil-2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex for pain treatment： physicochemical， cytotoxicity， and pharmacological evaluation[J]. J Pharm Sci， 2012， 101（10）： 3698.

[7] Haruyasu A， Takuya L， To Toshiyuki K， et al. Unique catalytic effect of a cyclodextrine host on photodimerization of coumarin in nonpolar solvents[J]. Tetrahedron Lett， 2013，54（7）： 688.

[8] Wang J， Cao Y， Sun B， et al. Physicochemical and release characterization of garlic oil-β-cyclodextrin inclusion complexes[J]. Food Chem， 2011， 127（4）： 1680.

[9] 马君义， 张继， 魏相龙， 等. 百里香挥发油β-环糊精包合工艺研究[J]. 中国现代应用药学， 2012， 29（5）： 422.

[10] Toshiyuki K， Takuya L， Yoshinori F， et al. Strong guest binding by cyclodextrin hosts in completing nonpolar solvents and the unique crystalline structure[J]. J Am Chem Soc， 2011， 13（17）： 4570.

[11] 何仲贵. 环糊精包合物技术[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2008.

[12] 王亮， 郭成功， 王彩旗. 基于β-环糊精和二茂铁主客体作用的超分子聚合物的制备及其凝胶化[J]. 功能高分子学报， 2012， 21（5）： 335.

[13] 冯瀚洲， 胡春晖， 朱春燕. 桉叶油羟丙基-β-环糊精包合物-原位凝胶复合系统的制备与评价[J]. 中国现代应用药学， 2012， 29（2）： 142.

[14] 陈方伟， 郭涛， 李海燕， 等. 双氢青蒿素羟丙基-β-环糊精包合物的制备与表征[J]. 药学学报， 2012， 47（4）： 529.

[15] 樊志， 刁春华， 宋海滨， 等. β-环糊精与水杨酸包合物的合成与结构[J]. 化学学报， 2007， 65（15）： 1449.

[16] 李申利， 刘翠格， 魏永臣. 土大黄苷的荧光光谱在其中药大黄分析中的应用[J]. 光谱学与光谱分析， 2008， 28（10）： 295.

[17] 李振， 高振坤， 龙君江. 盐酸沙拉沙星-β-环糊精包合物的制备[J]. 西北农林科技大学学报： 自然科学版， 2013， 41（3）：1.

[18] 李满秀， 赵二劳， 薛园园. β-环糊精增敏荧光法测定氯氰菊酯的研究[J]. 分析科学学报， 2007， 23（5）： 592.

[19] Sergry V， Kurkov E， Ukhatskaya T L. Drug/cyclodextrin： beyond inclusion complexation[J]. J Incl Phenom Macro， 2011， 69（3/4）： 297.

[20] Williamson B， Krishnaswamy R， Tonelli A E. Physical properties of poly（ε-caprolactone） coalesced from its α-cyclodextrin inclusion compound[J]. Polymer， 2011， 52（20）： 4517.

[21] 张倩， 张晶， 周欣， 等. 羟丙基-β-环糊精对他克莫司的增溶作用[J]. 中国药房， 2010， 21 （25）： 2339.

[22] 葛竹兴， 张小华. 甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备和鉴定[J]. 南京师范大学报： 自然科学版， 2008， 31（4）： 74.

[23] 郭丽蓉， 周丽玲. 冰片-β-环糊精包合物制备方法的比较研究[J]. 时珍国医国药， 2011， 22（6）： 1462.

[24] 赵燕燕， 李丽， 刘宇， 等. 阿魏酸环糊精包合物的制备及体外经皮通透性的评价[J]. 中国医药工业杂志， 2010， 41（5）： 339.

[25] Eki S， Tao L， Liu J Q， et al. Bioderadable star polymer functionalized with β-cyclodextrin inclusion complexes[J]. Biomacromolecule， 2009， 10（9）： 2699.

[26] 肖玉梅， 王健， 刘吉平， 等. β-环糊精丁吡吗啉的包合作用[J]. 高等学校化学学报， 2009， 30（4）： 720.

[27] 张毅民， 李潇， 孙聪善， 等. 羟丙基-β-环糊精/格列吡嗪包结物的制备及其光谱研究[J]. 光谱学与光谱分析， 2008， 28（3）： 71l.

[28] 胡勇， 凌鹏远， 徐金瑞. 环糊精与溴氰菊酯包合作用的紫外光谱法研究[J]. 广东化工， 2012， 17（39）： 36.

[29] 蒋永海， 朱辉. 妇炎消胶囊中非法成分土大黄苷的检测[J]. 中国现代应用药学， 2011， 28（10）： 959.

Study on preparation of deoxyrhaponti-β-cyclodextrin super-molecular

inclusion complex and performance of inclusion complex

GUO Ming*， WANG Chun-ge， YIN Xin-xin， DU Hong-chen

（School of Engineering， Zhejiang Agriculture & Forestry University， Lin′an 311300， China）

篇（6）

[中图分类号] R541.78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2009）13-38-02

The Brain Protective Effect of Different Dose Edaravone by Ear Intravenous Injection in CPR Rabbits

LIU Lin1 CAO Huanjun1 ZHANG Chengming1，2

1.Department of Anesthesiology，Weifang Medical College；2.The Department of Anesthesia，Weifang Medical College Affiliated Hospital，Shandong 261042

[Abstract] ObjectiveTo investigate the effect of edaravone on brain in the rabbits by cardiopulmonary resuscitation. Methods30 rabbits were randomly divided into three groups：NS，low-dose edaravone-treated and high-dose edaravone-treated groups. Each group had 10 animals. The contents of SOD and MDA in serum were assessed 30min，2h，4h after the cardiopulmonary cerebral models were established. ResultsCompared with the NS group，serum SOD in edaravone groups were significantly higher，but serum MDA in edaravone groups were significantly lower；Compared with group S，the serum SOD in group H was significantly higher，serum MDA of group H was significantly lower. ConclusionEdaravone has protective effect on brain in the rabbits after cardiopulmonary resuscitation，especially the high dose.

[Key Words]Edaravone； Cardiopulmonary resuscitation； Brain protection； MDA； SOD

心肺复苏是危重疾病的抢救和治疗过程中经常遇到的问题，复苏成功后由于长时间的缺血缺氧，脑组织可能造成不同程度的损伤。目前认为缺血再灌注后氧自由基增多是导致脑损伤加重的主要原因[1]，而超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等是反映氧自由基水平的主要观察指标。依达拉奉（3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮）是新一类羟自由基清除剂，临床上主要用于脑梗死的治疗。各项实验研究证实，依达拉奉对缺血性脑损伤有保护作用[2，3]，能改善缺血性脑损伤患者神经功能的预后。本实验拟通过检测家兔血清SOD、MDA水平的变化，旨在评价不同剂量的依达拉奉液对心肺复苏后家兔脑组织的保护作用，为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与器材

（1）主要试剂：超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

（2）仪器：微量注射器（宁波市三爱仪器厂）；4°离心机（上海安亭科学仪器厂）；722s分光光度计（上海精科公司）；DW-2000动物呼吸机（上海嘉鹏科技有限公司）；PM- 9000便携式多参数监护仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

1.2 实验动物及分组

5月龄健康家兔30只，雌雄不拘，体重（2.50±0.30）kg，由潍坊医学院实验动物中心提供。实验动物用随机数字表法分为3组：生理盐水组（N组）、小剂量依达拉奉组（L组）、大剂量依达拉奉组（H组），每组10只。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制作 心肺脑复苏动物模型的制作参照文献[4，5]进行。实验前禁食12h，耳缘静脉推注氯胺酮10mg/kg诱导，氯胺酮100mg加入250mL林格氏液内静脉输注维持麻醉，保持家兔肢体无体动，呼吸、心率平稳。环甲膜做T形切口，插入气管导管，接上动物呼吸机行机械通气。分离胸前皮肤，打开胸腔，暴露心脏。直流电约20mA，正极在右心房，负极在左心室，行电刺激诱发室颤，直至有创血压低于30mmHg，维持5min。手法心肺复苏，直至有创血压高于60mmHg，且能稳定维持为复苏成功。另从右侧耳缘静脉泵入相应干预药物。

1.3.2 给药剂量 本实验采用2种给药剂量，即耳缘静脉持续泵入依达拉奉液（由江苏先声药业有限公司提供）1mg/（kg・h）， 3mg/（kg・h），对照组给予适量生理盐水。

1.3.3 血清SOD、MDA含量测定 复苏后30min、2h、4h分别抽取左侧颈静脉血液3mL，6h内离心（3000r/min）15min后弃去下层，取上层血清测定SOD、MDA含量。血清SOD含量测定采用黄嘌呤氧化酶法。血清MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法。以上严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 统计学处理

所测数据以均数±标准差（χ±s）表示，采用SPSS13.0分析系统对定量数据进行组间t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 血清SOD含量比较

与N组比较，H组血清SOD含量明显升高，差异有显著性（P＜0.05）；L组SOD含量开始升高不明显，但随着时间的延长也显著升高。与L组比较，H组血清SOD含量明显升高（表1）。

2.2 血清MDA含量比较

与N组比较，L组与H组血清MDA含量开始虽然降低，但差异无显著（P＞0.05）。随着时间的增加，H组血清MDA含量明显降低，差异有显著性（P＜0.05），L组MDA含量也显著降低（P＜0.05）。与L组比较，H组血清MDA含量明显降低（表2）。

3 讨论

心肺复苏后引起的一系列病理生理变化均可导致复苏后全身性炎症反应综合征，继而发生多脏器功能障碍综合征，直接影响着复苏的预后。脑组织较其他脏器更易遭受缺血缺氧性损害，复苏后存在脑损伤、脑缺血缺氧等病理情况以及体内酶系统保护作用减弱，氧自由基生成过多。脑内产生的大量氧自由基通过脂质过氧化作用及与膜蛋白的反应造成脑细胞、血脑屏障的过氧损伤，导致细胞毒性、血管源性脑水肿，加剧脑的继发性损害。

监测血清SOD、MDA水平对研究心肺脑复苏后缺血缺氧情况有重要意义。SOD作为内源性氧自由基清除剂的代表，其活力在一定程度上反映了内源性氧自由基的清除活力，大量SOD对缺氧缺血性脑损伤有明显保护作用[6]。MDA是自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，代表氧自由基的含量，测定MDA含量可以反映出组织含有氧自由基的多少[7]。本实验结果显示：H组血清SOD含量明显升高，L组血清SOD含量升高不如H组明显，说明大剂量依达拉奉治疗产生的大量SOD对心肺复苏后的脑保护作用显著。依达拉奉治疗后血清MDA含量明显降低，说明氧自由基含量明显减少，从而减轻脑损伤。

依达拉奉是亲脂性基团，对血脑屏障的通透率为60%。作为一种新型自由基清除剂，它通过提供一个电子给自由基，从而清除体内活性氧分子，抑制脂质过氧化[8]，同时也保护血管内皮细胞，抑制迟发性神经细胞死亡，从而减轻神经细胞损伤[9]。

目前依达拉奉已广泛用于临床治疗缺血性脑血管病，通过清除自由基，抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶的活性，降低羟自由基的浓度，减轻脑损伤，对缺血的脑组织发挥神经保护作用。结果证实，心肺复苏后静脉注射依达拉奉液对心肺复苏后家兔有一定脑保护作用，且呈剂量依赖关系，为其在心肺复苏后对患者临床治疗中的应用提供了理论依据。

[参考文献]

[1] 姜德华，金男革，玄汉石，等. 大鼠急性局灶性脑缺血再灌注脑组织NO含量和NOS活性的变化[J]. 临床神经病学杂志，2000，13：201.

[2] Eiichi O. Effect of a novel free radical scavenger，Edaravone（MC1-186），on acute brain infarction[J]. Cerebrovasc Dis，2003，15（3）：222-229.

[3] Zhang N，Komine-Kobayashi M，Tanaka R，et a1. Edaravone rduces early accumulation of oxidative products and sequential inflammtory responses after transient focal ischemia in mice brain[J]. Stroke，2005，36（10）：2220-2225.

[4] 黄唯佳，李章平，陈寿权. 心肺脑复苏动物模型[J]. 中华急诊医学杂志，2002，11（6）：419-420.

[5] Idris AH，Becker LB，Ornato JP，et al. Utstein style guidelines for uniform reporting of laboratory CPR research[J]. Circulation，1996，94：2324-2336.

[6] Lee BI，Chan PH，Kim GW. Metalloporphyrin-based superoxide dismutase mimic attenuates the nuclear translocation of apoptosis-inducing factor and the subsequent DNA fragmentation after permanent focal cerebral ischemia in mice[J]. Stroke，2005，36：2712-2717.

[7] 王万铁，徐正怠，林丽娜，等. 心肌缺血再灌注损伤时MAP与MDA的相关分析[J]. 温州医学院学报，1997，27（2）：76-78.

篇（7）

一、“突破辽西北”战略中生态环境保护的地位分析

2015年2月3日，《辽宁省人民政府关于进一步深入实施突破辽西北战略的意见》出台并再次强调，“十三五”期间，推进生态环境保护，着力实现绿色发展是突破辽西北战略的重点任务之一。

在实施“突破辽西北”战略过程中，要正视资源环境承载力。加强环境保护和生态建设，是突破辽西北区域发展战略的重要保障。

二、辽西北农业生态环境保护法律制度体系方面存在的问题

辽西北地区长期以来工业发展相对缓慢，再加上该区域农业经济的粗放经营导致水土流失、土地沙化、水资源浪费等生态破坏加剧，资源环境承载力极其脆弱。脆弱的生态环境极大地制约该地区的经济社会发展。辽西北地区农业生态环境保护法律制度体系方面存在的问题，主要表现为：

1、在立法上，农业生态环境保护法律体系不健全。《中华人民共和国环境保护法》为主体的环境保护法律体系虽已初步建立，但其对农业环境保护的规定缺乏，使得许多农业生态环境保护工作难以开展。

2、在执法层面，执法手段和措施单一。农业生态环境保护领域统分结合的分层管理体制效率低下，且极易导致各执法部门互相推诿和争权夺利现象产生。农业主管部门和环保部门都可以行使行政执法权，加之地方保护主义导致的执法不严、违法不究等违法失职现象，使得农业生态环境保护陷入一个异常混乱和尴尬的局面。

3、在运营环境上，相关制度协调性较差。许多生态环境法律制度虽已建立，但制度之间的配套性和协调性较差。在有关农业生态环境保护方面，缺乏必要的制度保障，如土壤污染防治、农业生态环境保护公益诉讼制度等。

4、在法律归责上，涉及生态环境保护的禁止性规定与法律责任规定不协调，法律责任规定相对较为宽泛不够严苛，使得现行环境保护法律法规既不足以震慑违法的当事人，也不能发挥应有的警示作用。

5、在法律监督上，相关部门认识，行政管理手段单一，过分偏于经济处罚，缺乏对于建立长远有效的法律监督机制的重视，致使农业生态环境遭到破坏，严重威胁当地农业经济社会的可持续发展。

三、完善辽西北农业生态环境保护法律体系的建议

辽西北生态环境保护法律体系所存在的问题使得改善该区域农业生态环境显得尤为重要。只有完善农业生态环境保护法律体系，才能更好的发展辽西北地区的农业经济，走可持续发展道路。

1、制定统一的农业生态环境保护法

面对辽西北地区农业生态环境的困境，应制定统一的《农业生态环境保护法》，以法律文件的形式规范对于农业生态环境管理;通过对现行环保法的修订，完善对于农业生态环境保护的专项规定。

2、强化农业生态环境保护执法力度

“天下之事不难于立法，而难于法之必行。”[1]在农业生态环境保护领域，建立垂直管理体制，以求增强管理和执法效率，避免部门间相互推诿和扯皮的现象的发生。通过赋予农业生态环境保护管理部门较多的行政许可、行政强制和行政处罚权，来增强其执法和管理权威;此外，应严厉打击地方保护主义，严格执法，对危害农业生态环境的违法犯罪行为，加大行政和司法打击力度，加强执法和司法保护。

3、明确农业生态环境违法行为的法律责任

农业生态环境保护中“无法可依”的现象层出不穷。因此，农业环境保护法必须对污染和破坏农业生态环境的行为作出相应的处罚规定，加大处罚力度，完善相关处罚指标体系，从重从严处理相关违法行为，保证农业生态环境保护管理工作的有序运行开展。

4、采用统一监督管理与分工负责相结合的农业生态环境保护监督管理体制

信息不公开、不对称是妨碍公众参与环境保护工作的重要根源。要不断完善农业生态环境信息公开立法，积极构建我国农业生态环境公开法律体系。“让权力在阳光下行使”，才能使得我国农业生态环境保护工作在公众的参与下得到有效监督。

结语

“突破辽西北”战略有利于提升全省经济整体实力，促进区域发展，也践行国家政策。因此，在这一过程中，要高度重视农业生态环境的保护工作，为经济社会的持续健康可持续发展提供十足的动力。（作者单位：沈阳师范大学法学院）

参考文献：

[1] 陈叶兰.论农业生态环境保护的良法之治.求索.2008.

[2] 韩广.杨兴.陈维春.中国环境法的基本制度研究.中国出版社.

[3] 张铣涛.我国农业生态环境立法现状及对策.当代生态农业.2009（21）.

[4] 汪志革.农业生态环境保护的对策研究..科技资讯.2010（16）.

篇（8）

【关键词】  槲寄生生物碱；P53；RT-PCR；人肝癌细胞株SMMC-7721

   

Abstract  Objective：To examine the effects of mistletoe alkali on P53 expression in Human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. Methods:MTT assay was used to evaluate the inhibitory effects of mistletoe alkali on the proliferation of human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. RT-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique was used to evaluate P53 mRNA expression in human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. Results:Mistletoe alkali significantly inhibits the growth of SMMC-7721 cells in a time and dose-dependent manner. After exposure of SMMC-7721 cells with mistletoe alkali at 0.100mg/mL for 24 hours, the relative intensity of P53 mRNA expression level as determined by RT-PCR increases markedly (P＜0.01). Conclusion:The stimulation of the expression of anti-oncogene P53 by mistletoe alkali may underlie the molecular basis for it to inhibit tumor growth

  

Key words  Mistletoe alkali； P53; RT-PCR； Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤的第二位[1]，且原发性肝癌具有起病隐匿、进展迅速、高度恶性、易转移复发、治疗难度大、生存期短等特点，被称为“癌中之王”[2]。目前肝癌以外科手术为首选治疗方案，但术后5年生存率并不理想，总体只有62.9%，大肝癌术后5年生存率仅34.6%。近年来应用传统的中药治疗日益受到重视。槲寄生为桑寄生科植物槲寄生［Viscum coloratum(Komar)Nakai］的干燥带叶茎枝，其味苦、平，归肝、肾经，有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎作用[3] ，且槲寄生有较好的抗肿瘤效果[4] 。本文从分子水平探讨槲寄生抑制肝癌的机制。

1  材料与方法

在哪

1.1  材料

1.1.1  细胞株  人肝癌细胞SMMC-7721，购于中国科学院上海细胞研究所。

1.1.2  主要试剂和仪器  RPMI1640(GIBCO)，胎牛血清(杭州四季青公司)，二甲基亚砜、MTT(Amersco)，RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒（宝生物公司），琼脂糖（Promega），引物（上海生工）、Forma CO2培养箱（美国），ELX-800酶标仪（美国），Enpddorf低温离心机（德国），PCR仪(美国)，紫外分光光度计（日立），倒置显微镜、凝胶成像系统（上海康乐）。

1.1.3  药物  槲寄生购于包头益仁堂中药房，山西医科大学药学系扬官娥教授鉴定该中药为槲寄生并非其他寄生。槲寄生生物碱由本校化学教研室予以提取。将提取物以碘-碘化钾试剂、碘化汞钾试剂检验呈阳性反应，证明提取物为槲寄生生物碱。

1.2  方法

1.2.1  体外细胞培养  细胞培养于含10%胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640培养基中, 37℃、5%CO2培养箱中培养,每2天换液1次。

1.2.2  MTT法测定槲寄生生物碱对肝癌细胞增殖的影响  取对数生长期的肝癌细胞调整至1×105/mL，取0.200mL接种于96孔板，置37 ℃、5%CO2培养24h后弃原培养液,加入浓度为0.200mg/mL、0.100mg/mL、0.050mg/mL、0.025mg/mL槲寄生碱培养液各0.200mL，每个浓度设6个复孔，分5次重复，并设阴性对照、5-Fu阳性对照（10μg/mL）和空白对照孔，同时作3个板。分别作用 24h、48h、72h后倾去上清液,用D-Hanks洗涤2次，各孔加入5%MTT 0.020mL，37℃4h后吸去上清液,加入DMSO 0.150mL,振荡10min使结晶充分溶解后上酶标仪490nm处测吸光度A值。抑制率(%)=(对照孔A值-实验组A值)/对照孔A值×100 %。依据MTT结果用改良寇氏法计算IC50。

1.2.3  槲寄生生物碱对人肝癌细胞SMMC-7721P53 mRNA表达影响的测定  （1）细胞给药：取对数生长期的SMMC- 7721细胞调整至2×105/ mL,2.500mL接种于6孔板,置37℃、5 %CO2培养箱，培养24h后弃原培养液,对照组加入不含药物的培养基2.500mL，试验组依据MTT结果加入含浓度为0.100mg/mL槲寄生生物碱培养液2.500mL培养24h(抑制率为38%)。（2）总RNA的提取：用RNAiso Reagent提取试剂,经氯仿抽提、异丙醇沉淀，分别提取实验组和对照组细胞总RNA。提取的总RNA用紫外分光光度计在260nm和280nm下检测其吸光度值，以A260nm/A280nm比值表示其纯度。（3）引物设计：参考文献[5-6] 及GenBank中基因序列设计引物。P53上游引物：5′-TGTCCCCGGACGATATTGAAC-3′，下游引物：5′ -TTCCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。（4）RT-PCR反应：逆转录取总RNA 1μL按反转录试剂盒要求配成10μL反应体系，实验组和对照组分别进行逆转录PCR反应。转录条件为30℃ 10min、50℃ 20min、99℃ 5min、5℃ 5min，共一个循环。（5）PCR反应：β-actin扩增条件: 94℃预变性2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环,72℃延伸8min。P53扩增条件：94℃预变性2min，94℃30s，56℃30s,72℃1min,35个循环,72℃延伸8min。

1.2.4  半定量分析  将扩增的RT-PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳45min。电泳结束后在紫外透射仪下观察电泳条带,于凝胶成相仪上进行目的条带的密度定量,以目的基因条带的密度与内参β- actin的密度之比作为该目的基因的mRNA的相对含量。

1.2.5  统计学处理  实验结果用SPSS 11.5统计分析软件处理，数据用x±s表示，行t检验,以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2  结果在哪

2.1  槲寄生生物碱对细胞增殖的影响  槲寄生生物碱对SMMC-7721细胞有显著生长抑制作用，且呈剂量和时间依赖方式，0.100mg/mL和0.200mg/mL浓度组在24h、 48h、72h均表现出抑制SMMC-7721细胞生长作用，抑制率分别为38%、52%、75%和52%、74%、93%，且作用强于5-Fu。 0.050mg/mL组及0.025mg/mL组也表现出抑制SMMC-7721细胞生长作用，在3个时间点抑制率分别为9%、21%、49%和0%、5 %、23%，但作用弱于5-Fu。

2.2  RT-PCR结果

2.2.1  总RNA抽提结果  所提取RNA经紫外分光光度计检测A260nm/A280nm比值为1.8，说明提取的样品为较纯的RNA。

2.2.2  槲寄生生物碱对人肝癌细胞SMMC-7721 P53 mRNA表达的影响  0.100mg/mL槲寄生生物碱作用24h后能增强人肝癌细胞SMMC-7721 P53 mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.01）。电泳及P53 mRNA/β-actin mRNA半定量见图1及表1。

图1  槲寄生碱对肝癌SMMC-7721细胞P53 mRNA表达的影响（略）

M为Marker，1、3为对照组，2、4为药物组，1、2为P53，3、4为β-actin内对照

表1  槲寄生碱对肝癌SMMC-7721细胞P53 mRNA表达的影响（略）

*与对照组比较P<0.01

3  讨论在哪

  

槲寄生是我国传统中药，分布广泛，在我国主要分布在东北、华北地区，资源丰富。为了开发利用天然资源，国内外的学者作了大量的工作。目前证实槲寄生有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、免疫调节、抗氧化、抗衰老等作用。目前研究较多的是槲寄生苷类的结构及槲寄生毒肽的抗肿瘤作用，对生物碱的研究不多。彭海燕等[7]的研究表明槲寄生生物碱在120mg/kg计量时对小鼠肝癌H22 的抑瘤率可达73.8%。肿瘤抑制基因是肿瘤遗传学及分子生物学的研究热点。P53基因与肿瘤关系最为密切。野生型的P53基因产物监控基因组的完整性，当DNA受到损伤时，野生型P53产物通过转译后的稳定作用，蓄积、促进细胞周期停留在G1期，用这额外的时间进行修复[8]。野生型P53基因的结构和表达异常是肝癌中最多的基因改变之一[9]。

  

本实验从分子水平探讨槲寄生生物碱的作用机理与基因表达的关系。我们选择了与肿瘤发生关系密切的基因P53作为研究对象，检测其mRNA的表达。研究发现，槲寄生生物碱0.100mg/mL作用于肝癌细胞株SMMC-7721 24h后，野生型P53表达增强。这表明槲寄生生物碱可能激活抑癌基因P53而使癌细胞死亡从而发挥其抗肿瘤作用。对于槲寄生生物碱作用后其他浓度及时间点基因表达的改变有待继续研究。

【参考文献】

 

[1] 中华人民共和国卫生部.1995中国卫生统计提要[C].中华人民共和国卫生部，1995：73.

[2] 张健，赵秀丽，翟玉萍.原发性肝癌中医药治疗进展[J].内蒙古中医药，2004,（6）:35-36.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:化学工业出版社，2005:258.

[4] 王庆瑞,刘梅筠,王东阳，等.槲寄生总生物碱的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志.1994,19(1):45-47.

[5] Khan ZA,Jonas SK,Le-Marer N,et al.P53 mutations in primary and metastatic tumors and circulating tumor cells from colorectal carcinoma patients[J].Clin Cancer Res,2000,6(9):3499-3504.

[6] Selvakumaran M,Lin HK,Miyashita T,et al.Immediate early upregulation of Bax expression by p53 but not TGF beta 1: a paradigm for distinct apoptotic pathways[J]. Oncogene，1994，9:1791-1798.

[7] 彭海燕,章永红,韩英,等.槲寄生碱抗肝癌作用试验性研究[J].实用中医药杂志，2004， 20(5):227-228.

篇（9）

【关键词】 金丝桃素　慢性高眼压　视网膜神经节细胞　神经保护　兔

The histology observation on the protective effect of hypericin on retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits

Abstract AIM: To explore the effect of hypericin on retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits. METHODS: Twenty rabbits were used to build chronic ocular hypertension model by posterior chamber injection of alpha-chymotrypsin. Ten days after successful model creation， hypericin 0.1mL or saline 0.1mL was injected into the vitreous cavity once a week for 2 weeks. Retinal ganglion cell of these eyes and that of four normal rabbit eyes were observed by light microscopy and electron microscopy. The thinckness of inner retina layer was examined.RESULTS: The number of retinal ganglion cell in saline-treated group decreased significantly. There was serious cell degradation with perinuclear condensation of chromatin and swelling organelles， but the change was slight in hypericin-treated group. The difference of the thickness of inner retina layer between the two groups was significant (P＜0.01).CONCLUSION: Intravitreal injection of hypericin as a protein kinase C antagonist can protect the retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits.

· KEYWORDS: hypericin; chronic ocular hypertension; retina ganglion cell; nerve protection; rabbits

0引言

青光眼是一组与眼压升高有关的致盲性眼病。它的病理基础是视网膜神经节细胞进行性死亡。目前青光眼的治疗主要是降眼压，但是单纯降眼压并不能阻止视功能的继续下降。随着视神经保护理论的提出和研究，视神经保护治疗越来越受到人们广泛的关注[1]。我们就是基于视神经保护治疗的理论，探讨一种蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制剂——金丝桃素对视网膜神经节细胞的保护作用。

1材料和方法

1.1材料 健康成年家兔24只，体质量2.0~2.5kg，无眼疾，雌雄兼用，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。金丝桃素和二甲基亚砜(sigma公司)、注射用糜蛋白酶（上海第一生化药业有限公司）、LZL-12型手术显微镜（镇江中天光学仪器有限责任公司）、Tonopen笔式眼压计（Medtronic Solan公司）。

1.2方法 健康成年家兔24只，随机挑选20只作为实验组，另4只作为对照组。实验组用200g/L乌拉坦5mL/kg，3min内注入耳缘静脉全身麻醉，每只兔随机选一眼作实验眼，的卡因点眼局部麻醉。用1mL注射器抽取400U 糜蛋白酶溶液0.2mL，从颞侧角巩膜缘进针，经瞳孔至对侧虹膜下注入后房，四环素眼膏涂眼。每日用Tonopen眼压计测眼压，眼压在30mmHg（1mmHg=0.133kPa）以上为慢性高眼压造模成功[2]。待高眼压模型眼压稳定升高10d后，随机挑选半数的高眼压兔作玻璃体内金丝桃素注射。金丝桃素用二甲基亚砜溶解，生理盐水稀释，终浓度为2μmol/L， 避光保存。实验兔乌拉坦全身麻醉加的卡因局部麻醉，在显微镜下用2mL注射器，从12点钟角膜缘后3mm处睫状体平坦部进针，抽出玻璃体0.1mL，注入金丝桃素0.1mL。1次/wk，连续2wk。另一半高眼压兔同上法操作，玻璃体内注入生理盐水0.1mL。1次/wk，连续2wk。正常兔4只，不做任何眼部和全身的处理，处死后进行下一步实验。第2次玻璃体注射后7d处死兔子，摘除眼球置于冰盒内，迅速去除眼前段，暴露并分离视网膜分别制作光镜电镜标本。光镜标本经40g/L福尔马林固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察并照相[3]。电镜标本经30g/L的戊二醛和10g/L的锇酸固定，乙醇丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅染色，电镜观察并照相[4]。观察所有家兔视网膜光镜下结构的变化并利用定量病理学的网格系统[5]，按J=LP．∑Pb/∑IA+∑Ib，计算视网膜内界膜至外核层内侧间的距离，以5次平均值(MTIRL)作为视网膜内层平均厚度[6]。

统计学处理:应用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，结果用 表示

2结果

我们采用后房注射α－糜蛋白酶的方法制备兔慢性高眼压模型。此方法高眼压发生快、持续时间长、眼压稳定。采用20只兔作为实验组造模，最终16只成功，其中一只因麻醉过量死亡，3眼压未达到预期水平，成功率为80%。造模后眼压一般在术后1wk内升高，实验眼呈牛眼状外观，眼球变硬，睫状充血，角膜水肿，前房加深，瞳孔散大。Tonopen笔式眼压计测得平均眼压为(34.12±2.31) mmHg，高眼压状态至少可维持2mo。

2.1光镜观察 光镜下见正常兔的视网膜组织结构清晰、完整，可观察到10层结构，外核层细胞数量最多，内核层细胞数量较少，节细胞为单层，形态呈类圆形（图1A）。生理盐水对照组视网膜内层变薄，神经节细胞数量明显减少，细胞出现变性，内、外核层细胞排列稀疏，数量减少（图1B）。金丝桃素治疗组损伤明显轻于生理盐水对照组，神经节细胞数量有所减少，胞核大部分存在，部分出现空泡样变，内核层和外核层结构与正常组所见相似（图1 C）。

2.2电镜观察 透射电镜下见正常视网膜神经节细胞核呈类圆形，染色质颜色清晰，分布均匀，内质网、线粒体等细胞器形态正常，细胞膜完整(图2A) 。生理盐水对照组神经节细胞明显减少，部分细胞严重变性，核结构稀疏，核仁固缩及偏位，胞质染色质边集，内质网肿胀，线粒体肿胀，嵴消失，空泡变性（图2B）。金丝桃素治疗组见部分核稍有变形，核染色质略显稀疏，颜色稍淡，线粒体空泡变性，残存线粒体嵴， 内质网仅见轻度肿胀（图2C）。视网膜内层平均厚度正常组为78.62±1.87μm， 金丝桃素治疗组为73.80±5.61μm， 生理盐水对照组为59.30±2.17μm。后两者相比有显著性差异(P＜0.01)。

图 1 兔视网膜神经节细胞 (HE×200) A：空白对照组正常；B:生理盐水对照组数量明显减少，出现变性；C：金丝桃素治疗组数量减少，胞核大部分存在

图 2 兔视网膜神经节细胞超微结构(TEM×106) A：空白对照组核居中，细胞器形态正常，细胞膜完整；B：生理盐水对照组核仁固缩，胞质染色质边集，线粒体、内质网等细胞器肿胀；C：金丝桃素治疗组核染色质浓集，线粒体空泡变性，残存线粒体嵴

3 讨论

在临床上作为一种抗病毒药、抗抑郁药应用的金丝桃素是一种PKC的特异性抑制剂，是从金丝桃家族中提取的一种紫色结晶颜料[7]。目前已经有研究表明，金丝桃素对增生性玻璃体视网膜病变也有治疗作用[8]。通过本实验我们观察到，应用金丝桃素玻璃体内注射，视网膜神经节细胞的形态结构相比生理盐水对照组损伤明显减轻，视网膜内层平均厚度也比生理盐水对照组厚。这说明金丝桃素可以直接增强节细胞对抗有害因素的能力，促进受损细胞的存活和功能恢复。

青光眼的主要危险因素之一是病理性眼压升高。慢性高眼压对视网膜神经节细胞损伤的机制主要是因为眼压升高迫使筛板组织变形，使得节细胞轴浆流受阻于筛板，由此引起逆行运向神经节细胞胞体的神经营养性因子减少，神经节细胞释放谷氨酸，细胞外间隙谷氨酸蓄积，节细胞发生凋亡[9-12]。本实验中生理盐水对照组节细胞数量明显减少，部分严重变性， 核仁固缩，胞质染色质边集，线粒体、内质网等细胞器肿胀就是细胞凋亡的早期表现。PKC是一类钙、磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可以通过一系列信号级联反应对谷氨酸受体和谷氨酸转运蛋白进行具有浓度和剂量依赖性的调节，使得细胞外间隙谷氨酸蓄积的同时，增强谷氨酸与其受体的作用，最终增加受体介导的兴奋毒性，导致视网膜神经节细胞的凋亡[13，14]。反之，PKC抑制剂则可拮抗这一作用。我们已经用实验证实了慢性高眼压兔不同时间点的视网膜谷氨酸含量都比正常值有所升高，而PKC抑制剂金丝桃素能拮抗这一作用。金丝桃素对视网膜神经节细胞组织学的保护作用，很可能是通过PKC抑制剂对视网膜谷氨酸含量的抑制这一机制来实现的。当然对于青光眼这种慢性疾病来说，反复玻璃体内注射，也是有其明显的不良后果的。因此，探讨金丝桃素的作用和调控机制，研究如何发挥其对青光眼视神经保护的治疗潜力，有待于我们今后进一步研究。

参考文献

1王艳.青光眼视神经保护治疗的实验研究. 眼科新进展，2002;22(3):16-18

2 Sears D， Sears M. Blood-aqueous barrier and alpha-chymotrypsin glaucoma in rabbits. Am J Ophthalmol ，1974;77(3): 378-383

3项敏泓，钟一声，张兴儒. 灯盏细辛对兔高眼压视网膜神经节细胞活性的作用. 眼科新进展，2005;25(5):414-416

4原慧萍，褚利群，王莉娜，王雅. 兔实验性高眼压视网膜神经节细胞的凋亡. 眼科研究，2004;22(2):180-182

5申洪，沈忠英，主编.实用生物体视学.广州:中山大学出版社，1991:113-114

6 Takahashi K， Lam T，Edward P，Buchi R Tso O.Protective effects of flunarizine on ischemic injury in the rat retina. Arch Ophthalmol ，1992;110:862-870

7Agostinis P，Assefa Z，Vantieghem A， Vandenheede JR， Merlevede W， Witte P De. Apoptotic and anti-apoptotic signaling pathways induced by photodynamic therapy with hypericin. Adv Enzyme Regul ，2000;40:157-182

8高前应，惠延年，王雨生.金丝桃素抑制兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变.眼科学报，2002;18(4):240-245

9王建洲，贺翔鸽，谢琳，岳红云，孙亚丽.Nogo蛋白在正常大鼠视神经视网膜的表达.国际眼科杂志，2006;6(6):1302-1304

10石晶明，蒋幼芹.兴奋性氨基酸与青光眼. 国际眼科杂志，2004;4(4):668-674

11 Quigley HA. Ganglion cell death in glaucoma:pathology recapitulates ontogeny. Aust NZ J Ophthalmol ，1995;23(2):85-91

篇（10）

What people wear glasses fast increase? The question in my mind kept wandering. Later, I looked at a very long time, also check the information from the Internet, finally reached the conclusion. The first big reason: no scientific methods to protect their eyes. Some classmates for a long period of time reading books, watching TV, Internet access, make the eye often is in a state of fatigue, and do not pay attention to eye health. Although our school asked the students are doing eye exercises on time, but part of the students or not to do a good job, some still hiding under the table. The second reason: genetic. Some parents are nearsighted, and pass on to their children. But this kind of situation seems to be not much, "small glasses," often because not sparing eyes.

Finally, counsels: we must cherish oneself only this pair of eyes, to make our every day is full of light!

眼睛是心灵的窗口，是获得各种知识的重要途径。生活中我们处处都离不开眼睛，如果没有眼睛，世界将会变得一片黑暗，如果我们的眼睛出了问题，学习和生活将会遇到很多困难。尽管这样，我们有很多人还是不爱惜眼睛。在我的周围，已经有越来越多的同学带上了“小眼镜儿”，我的视力也逐渐下降，后来被医生诊断为假性近视。所以，保护眼睛这一点也被越来越多的人们重视起来。