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中图分类号:B842 文献标识码:A 文章编号:1006-026X(2014)01-0000-01
1.引言
以往英文词汇记忆策略的研究,不外乎两个出发点:―是以英文单词的结构为出发点,一是以英文单词的语境为出发点。以英文单词的结构为出发点,英文词汇的记忆策略大致包括;机械复述策略,汉字拟音策略,构词解析策略和意义加工策略。以英文单词的语境为出发点,英文词汇的记忆策略主要包括语境法。
虽然汉字拟音策略、构词解析策略、意义加工策略较机械记忆法在记忆效率上有很大提高,但归根结底仍是一种外显学习,即一种有意识的记忆,需要学生付出较多的注意力。在繁复的记忆任务面前,学生的学习积极性能保持多久呢?形成的表象或语句联想虽然能启动音义关系或形义关系,但这种关系能否保持得牢固和长久呢?
2.理论研究
内隐学习和外显学习之间既有区别,也有着联系。虽然在内隐学习研究的早期,人们从实验逻辑上习惯于将内隐学习看作和外显学习完全独立的全新系统,但实验室研究表明内隐学习和外显学习在绝大多数情况下是混杂在―起的,有机结合的。大部分学习任务既包含了外显学习,也包含了内隐学习。
就内隐和外显学习的关系而言,研究表明了两者的相互作用。其产生的内在机制是内隐学习的抽象性,外在条件是外显学习的适时配合。由此推论,学习复杂任务时应先具备一个内隐知识基础,然后再试图建立外显的任务模型。
内隐学习和外显学习是两个对立的概念,因此当内隐学习提出之后,早期研究者都更加注重内隐学习和外显学习之间的区别,总希望通过纯粹有效的分离手段论证内隐学习的绝对独立性。就像Lewicki(1986)曾提出的,内隐获得的知识完全独立于外显知识。Reber(1976)和Broadbent(1988)也强调两种学习的独立性。然而随着内隐学习概念本身的不断成熟和发展,研究者势必要考虑到内隐和外显两种学习同时处在学习过程的大范畴下,更重要的是它们毕竟同时整合在同一个有机体――人类的适应行为中。因此,内隐学习和外显学习不应只有区别而没有联系,它们之间的关系不可能绝对独立,而应该是相对对立又有着相互作用的。
理解内隐学习和外显学习之间存在的相互作用,不仅有助于我们从理论上更好地贴近人类学习过程的复杂本质,也同时具有实践的意义。
3.实验研究
3.1实验设计
实验设计:本实验为2×2混合实验设计。自变量为学习方式和材料难度。学习方式为被试间自变量,有外显和内隐与外显相结合两个水平;材料难度为被试内自变量,有难度低和难度高两个水平:因变量为被试记忆保持量,记忆保持量以自由回忆测试为主。
3.2被试
被试为武汉外语外事职业学院2011级的学生120人。所有被试都是自愿加入,实验结束后可获得本课程部分平时成绩。把他们随机分为A、B、C三组(每组40人),分别学习谐音记忆材料、会意记忆材料和词根词缀记忆材料;再将A、B、C组分别平均分为A1、A2组,Bl、B2组,C1、C2组(每组20人),作为外显组和结合组。
3.3实验材料
实验使用的材料分为3类:一类为谐音记忆材料(汉字拟音材料);―类为会意记忆材料(意义加工材料);一类为词缀记忆材料(构词解析材料)。三类材料分为三个实验,被试数量相同,分别同时进行。
实验材料皆选自GRE词汇表,且经过预实验证聪该实验材料对于被试来说皆为生词。每份学习材料包括50个生词,只计算中间40个生词的回忆成绩,前20个为较简单的生词,后20个为较难的生词,随机排列。
3.4实验过程
实验按照以下程序进行:告诉结合组被试他们要参加一个英语单词记忆测试,他们会先看到一些有关该单词拼写的提示;然后他们会看到该单词的助记联想和该单词中文意思的汉语拼音和颠倒词。他们的任务是根据以上这些提示生成该单词的正确拼写及其中文意思。要求被试把答案写在学习手册上。被试每过10秒就必须翻页。在所有刺激呈现完毕后,进行10分钟的自由回忆测试;接着进行10分钟的词干线索回忆。最后,进行10分钟的中文线索回忆,以词干线索回忆中的词干为线索,要求被试进行回想,将对应的中文意思写出。告诉外显组被试他们要参加一个英语单词记忆测试,他们会看到英文单词及其中文意思,他们也会看到一些有关该单词的助记提示,比如与某词谐音,像形等等,不要求被试自己生成单词和中文意思;在所有刺激呈现完毕后,进行自由回忆。
3.5统计方法
用Excel对实验数据进行统计处理。
4.实验结果
4.1实验数据统计
外显组和结合组学习了谐音材料后,进行自由回忆测验,回忆出一个完整英文拼写得1分,回忆出一个中文得1分,能将相应的中文与荚文对应起来得1分。
4.2实验结论
在自由回忆测试中,学习方式和材料难度的交互作用显著。具体而言,学习难度高的材料;外显与内隐相结合的学习方式与外显的学习方式差别不大,外显与内隐相结合的学习方式没有体现出优势;学习难度低的材料,外显与内隐相结合的学习方式较外显的学习方式效率高。
实验证明内隐学习与外显学习相结合的学习方式是一种高效的单词学习方式。
参考文献:
20世纪末,随着以“中华文化为母语的音乐教育”①口号的提出,越来越多的学者开始把关注点放在对中国传统音乐文化自身的继承与发展上面。而少数民族地区因其独特的人文风情,拥有着丰富的民族音乐文化资源,这些已然成为少数民族地区学校音乐教育的关注点,但是少数民族地区一般都是经济欠发达的贫困地区,教育资源相对贫乏,尤其是在音乐教育方面,普遍存在着师资力量薄弱、教学设施匮乏、教育理念落后等现象。
一、当前少数民族地区学校音乐教育的现状
由于经济欠发达,桑植地区现今仍属处于国家标准之下的贫困县范畴。由此,在学校音乐教育中所体现出的问题尤为突出。
(一)教学资源极度缺乏仍旧是制约学校音乐教育发展的重要因素
教师队伍薄弱。教师是课堂教学活动的引导者、参与者,是音乐教学中不可缺少的部分。然而在桑植一些偏远的“老、少、边、穷”地区,音乐教师的缺乏仍是制约其学校音乐教育发展的重要因素。相较于桑植县城镇地区的音乐教育而言,位于桑植县偏远的乡村地区,音乐教师的缺乏是存在的普遍现象。尤其是在一些偏僻的乡村学校,音乐教师的岗位常常处于缺乏的状态,甚至一些学校根本就没有专职的音乐教师,音乐课一般由文化课老师兼任,这种状况,严重制约了音乐教育的良好开展。
教学设备匮乏。教学设施包括专门的音乐教室,多媒体设备,各种乐器,辅助实施设施及教材等。其中,最主要的是器材。音乐器材的演绎,是音乐的重要表达形式,因而教学设备对于音乐文化的有效传播起着十分重要的作用;同时,随着互联网时代的到来,多媒体教学在现今社会已然成为了不可或缺的一种教学手段,利用多媒体创设情境,让学生身临其境的感受音乐并融入到音乐学习的文化语境之中去,可以有利于学生更好的理解音乐文化。而桑植地区除了极少数城镇学校配置了音乐教学所必备的相应设备之外,大部分学校连音乐课所必需的基础设施都没有,甚至于在一些乡村小学,每位同学一本音乐课本都是不具备的,这对于学生来说,是多么的可悲!
(二)落后的教学理念是制约当前学校音乐教育发展的主要因素
首先,应试教育背景下忽视了音乐教育的价值。音乐教育对学生健全人格的塑造,创造力思维能力的培养以及自信心的树立等方面有着其它学科所不能替代的作用。但在现行应试教育的背景下,在大多数老师以及家长的思想观念中,音乐课是可有可无的。特别是在“老少边穷”地区的学校这种情况尤为突出。为了在中考、高考中能够取得好成绩,音乐课时被大量占用的现象实属常见。一些教师认为对于身处于偏远地区的学生而言,应该把更多的时间用在文化课的学习上面,只有学好文化课,在考试中取得好成绩,考出高分数才是学习的唯一目标。
其次,音乐课缺乏以文化理解为目标的教学范式。长期以来,学校的音乐教学过程仍旧以教授音乐基础知识和音乐基本技能的“双基”为音乐教学主要目标,甚至是唯一目标。而音乐课的教学模式则为老师给学生教唱一首歌曲,学生通过对音符的学习而学会了该首歌曲,音乐课的任务就算是完成了。而学生对于歌曲所要表达的内容是什么、歌曲背后所蕴含着什么样的文化全然不知。这种缺少文化背景的音乐教学,实际很难达到音乐教育的目的,也不可能让学生真正懂得音乐的内涵。
再者,刻板的教学方式是对音乐教育错误认识的直接体现。许多老师、家长乃至于学生,都没有充分认识到音乐教育的重要性,没有将之作为一门重要的学科来对待,使得音乐课成为了“纯玩课”、“休闲课”、“应付课”、“教唱课”。在桑植县偏远的乡村学校,此种情况尤为突出,音乐课的上课方式为老师教唱一首歌曲,在教唱的过程中,老师先唱一句,学生紧跟着学唱一句,由此刻板循环,直至学生学会为止。整堂课下来,学生犹如“复读机”一样,只知道一句一句的重复老师所唱,一味的机械式的被动学习,而没有充分的发挥自己的主观能动性,其主体地位没有得到实现。
二、少数民族地区学校音乐教育的发展方向
基于以上现象,笔者认为,边远落后少数民族地区的音乐教育,在发展中应当着重从以下几方面入手。
(一)树立正确的教育思想,重视音乐教育
音乐是与生命、生活息息相关的一种艺术形式,是生命意志的直接表现。音乐生于人心,与人的情感联系非常紧密。“凡音者,生人心者也。情动于中,故形于声。声成文,谓之音。”②人的所思所想,喜怒哀乐,素质修养,都会通过音乐表现出来。因而音乐本身就是人类生活的重要组成部分,没有哪一个民族不热爱。再者言之,“致乐以治心者也。”③音乐是社会生活中最广泛又最容易为人们接受的文化形态,也是提高生活质量最直接、最有效的手段,对人的思想、人格、情趣等各方面健康成长具有重要意义,必然成为育德启智和调节情感,提高素质的重要工具。
(二)创办特色教学,将民族音乐纳入到音乐教育之中
近年来,在重视、发扬和传承传统文化的时代背景中,音乐界“以中华文化为母语”的音乐教育理念,呼吁重视中华传统音乐文化,使学生在学习音乐的同时能够理解其所蕴含的文化,理解音乐文化成为了音乐学习的一个重要方面。笔者认为,落实这一理念,关键在于两个方面:一是坚持传统乐教理论,坚守人格培育、美化生活的方向。今天我们的音乐教育,就应当采用优良的音乐资源引导教育学生,接受高尚,拥抱正能量,最终走向幸福美好的前景;二是抓住民族音乐的灵魂,将音乐教育扎根于民族传统文化的沃土之中,中华民族几千年的文化当中,不乏丰富的音乐理论和音乐教育理论,拥有众多令世界惊叹的音乐表现形式。
(三)将学校作为保护、传承和弘扬本地音乐文化的主渠道
少数民族是擅长歌舞的民族,其独特的民俗风情孕育着多姿多彩的音乐文化,桑植县是一个少数民族聚居地区,孕育出了桑植民歌、土家族摆手舞、白族仗鼓舞等多种民间艺术形态,但是现今随着大量年轻人离开村寨外出打工,民族文化难以为继,大多数传承模式都是靠个别年逾古稀的传承人带几个亲传弟子,无法大面积保留和规模化传承,使得一些文化遗产濒临灭绝。因此,将本地特色的音乐文化遗产的保护传承与学校音乐教育相结合,以学校为依托,利用学校音乐教育来发掘传承本地音乐文化,使学校成为其宣传、保护、传承的主渠道,对于保护本地音乐文化是一种行之有效的方式。
现今,随着多元文化背景下的文化冲击,越来越多的学者开始把注意力聚焦在对中国自身传统文化的继承与发展方面,保护好、发展好本地的特色文化成为大家普遍关注的问题,学校作为文化传播的主要途径,理应承担起传承民族音乐文化的重任。但是由于受到种种条件的制约,致使现今大多数少数民族地区的学校音乐教育状况都不容乐观,无论是教学资源,还是教学理念,都存在一定的问题,这就需要切实下大力去改善,一方面地方政府应当加大对少数民族地区学校基础设施的投入,另一方面组建专门的民族音乐师资队伍,更新教育理念,赋予学校研究、传承和保护地方民族音乐文化遗产的责任。由此,不但可以发展少数民族地区的学校音乐教育,体现少数民族地区学校音乐教育的鲜明特色,且通过学校音乐教育的方式来保护和开发本地的音乐文化,从而拓宽了保护传承的渠道,使得少数民族地区的民间音乐文化得以更好的保护与传承。
注释:
①关新.《中华文化为母语的音乐在京研讨会纪要》,《中国音乐》,1996.2
②王书良等:《论语・秦伯》中国文化精华全集哲学卷,北京:中国国际广播出版社,1992:83.
③《礼记・乐记》,北京:北京华文出版社,2009:331.
参考文献:
[1]谢嘉幸,郁文武.音乐教育与教学法[M].北京:高等教育出版社,2006.
关键词:地中海贫血;多重PCR;筛查
Investigation into the methods of screening thalassemia gene in LI Nationality population in Hainan.
Abstract:Objective To find a method that can be used for massively screening of thalassemia gene Li Nationality community. Methods Multiplex-PCR was used for screeningβ-thalassemia carriersβ°CD41/42)and theα 2 gene deficient carriers in a sin-gle reaction. Results Out of the1207Li Nationality samples123thalassemia carriers(accounted for10%)and212completeα 2 gene deficient carriers(including3HbH disease patients)were detected. Conclusion The method is suitable for scredning tha-lassemia gene carriers in Li Nationality population.
Key words:Thalassemia;Multiplex-PCR;Screening
地中海贫血是我国南方常见的一种遗传性血液病,其共同特点是由于珠蛋白基因缺失或缺陷使血红蛋白中珠蛋白链合成受抑制,导致血红蛋白成分组成结构发生改变,临床上以慢性进行性溶血性贫血为主要表现,轻型可无或仅有轻度贫血,重者有严重贫血、肝脾肿大、生长发育落后及骨骼改变等,目前除干细胞移植外尚无其他有效的根治方法。重症患儿需输血以维持生命,大部分患儿因输血并发症或严重贫血死于成年之前,严重影响家庭和儿童生活质量。海南是地中海贫血高发区,尤其在黎族人群中β-地贫的发生率高达6%~8% [1],且95%以上为β°CD41/42(-TCTT)突变。α-地贫基因携带率55.1% [2] ,以缺失型多见,而无论α 3.7 或α 4.2 的缺失都与α 2 基因有关,根据这些特点,设计一种在群中以筛查β°CD41/42(-TCTT)及α 2 基因为目的多重PCR技术,为海南省黎族人群优生工作提供简易可行的实验方法。
1 材料与方法
1.1 样品来源 在海南6个县、市五个支系黎族人口选择并签署知情同意书的1207人(其中陵水县343例、白沙县265例、通什148例、保亭县343例、东方县149例、乐东县144例),各取外周血0.1ml,置于含EDTA10μl在抗凝管中混匀。
1.2 群体筛查 每例标本各取抗凝血10μl用于血红蛋白电泳和红细胞脆性试验(按本科室常用方法)。
1.3 DNA提取 取0.1ml抗凝血分离白细胞,按常规方法用chelex-100提取DNA样品 [3] 。
1.4 PCR扩增
1.4.1 引物设计 P 1 Gen Bank HumHBA 4 编号7369-7388 5 -GCTGACCTCCAAATACCGTT-3 P 2 Gen Bank HumHBA 4 编号7548-7525 5 -CCATTGTTGGCACATTCCGGGACA-3P 3 Gen Bank HumHBGL 3 编号387-413 5 -TCTACCCTTGGACCCAGAGGTTGA-3P 4 Gen Bank HumBGL 3 编号665-643 5 -TCCTATGACATGAACTTAACCAT-3P 5 Gen Bank HumBGL 3 编号1055-1074 5 -GTGTACACATATTGACCAAA-3 P 6 Gen Bank HumBGL 3 编号1477-1457 5 -AGCACACAGACCAGCACGTT-3
其中P 1 -P 2 为扩增α 2 基因引物对,扩增片段为180bp,P 3 -P 4 为扩增β°CD41/42(-TCTT)引物对,扩增片段为275bp,P 5 -P 6 为扩增正常β-链基因引物对,作为本试验的内对照物,扩增片段长度423bp。
1.4.2 试剂配制 P 1 -P 2 各3.0μl、P 3 -P 4 各3.0μl、P 5 -P 6 各4.0μl;10mM dNTP10μl;10×Buffer(MBI)50μl;25mMMgCl 2 50μl;双蒸水300μl;配成反应混合液,每管分装20μl。
1.4.3 反应条件 取试剂20μl,样品3μl,加入MBIE1.0U/μl配剂反应混合液94℃预热5min,然后94℃30s,55℃40s,72℃45s,32个循环后,72℃5min延伸。
2 结果
经2%琼脂糖凝胶电泳后,结果显示正常者只出现两条区带一为α 2 基因的180bp区带;一为作为实验正常对照的β基因的423bp大小的区带。若180bp带缺失为α-地 2 纯合子;出现275bp为β°CD41/42的杂合子。见图1。
图1 地中海贫血α 2 全缺和β°CD41/42复合体PCR扩增电泳图(略)
1:α 2 全缺;2、4:正常;3:β41/42杂合子;5、6:α 2 全缺及β41/42复合体
在1207例样品中检出β°CD41/42(-TCTT)携带者123例,占10%;检出α 2 基因全缺212例,占17.6%(其中HbH病例3例),至于是否左侧或右侧缺失再作进一步分析(另文讨论)。
3 讨论
地中海贫血在东南亚及我国南方发病率非常高,由于不同程度的α珠蛋白基因缺失使其表型各异,临床表现不同,单个或二个α基因的缺失在临床上症状轻微甚至无任何临床症状及血象改变,故易被漏诊。由于中国人中常见的缺失型地贫--α 3.7 、--α 4.2 和-- sea 均与α 2 基因有关 [2] ,因此对α 2 基因进行筛查,可检出缺失型HbH、及左侧或右侧缺失型的α-地 2 基因的携带者,本方法虽能检出α-地 2 基因的纯合子,结合电泳图谱可检出缺失型HbH患者,但如进一步确诊尚须鉴定左侧抑或右侧缺失;且本方法虽然未能检出约5%除基因型为β°CD41/42以外的β-地贫,但可借助Hb电泳、红细胞脆性试验及HbA 2 定量,对疑似β-地贫患者进一步做斑点杂交法进行确诊。本筛查法简便、可靠、经济易行,用时可采用快速法提取DNA,可在3~4h内得到结果。因此本法适用于β°CD41/42及α-地 2 高发区人群基因筛查;对于重型地贫的预防,提高人口素质有重要的意义。
参考文献
[1]陈洛夫,黄冬爱,文平中,等.95例黎族人地中海贫血基因类型分析[J].海南大学学报自然科学版,1993,11(2):47~49.
1土壤宏基因文库的构建
关于土壤宏基因组学技术的构建已有许多研究报道,文库的构建需要足够高质量的DNA,由于土壤微生物往往会与土壤其他组分紧密结合,这就增加了提取土壤DNA的难度。常用的方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法是将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理,使其释放DNA,继而抽提纯化;间接提取法是首先去除土壤等杂质,通过不同的离心速度从土壤中分离出细胞,然后对细胞进行抽提。直接提取法提取的DN段较小(1~50kb),提取率高,操作简单;间接提取法提取的片断较大(20~500kb),纯度高,但操作繁琐,有些微生物在分离过程中会丢失。
根据插入片断大小,可以把基因文库分成2类:质粒载体的小片段插入(小于15kb)和柯斯质粒(15~40kb)或BAC(细菌人工染色体)(超过40kb)载体的大片段插入。大肠杆菌(Escherichiacoli)是表达土壤细菌基因或基因簇的通用宿主,穿梭载体或BAC文库可将大肠杆菌包含的文库信息转移至其他宿主如链霉菌或假单胞菌。
载体系统的选择取决于所提取土壤DNA的质量及研究目的,包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。如对腐殖质含量较高或剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库,小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子;而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则需要构建大片段和大容量的载体文库。Rondon直接把环境DNA克隆到低拷贝BAC载体,以大肠杆菌作为宿主构建了含100Mbp的小文库(SL1),并从这个文库中检测到DNA酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。
2土壤宏基因组文库的筛选
宏基因文库的筛选主要有功能驱动筛选、化合物结构水平的筛选、序列驱动筛选,底物诱导基因表达筛选。功能驱动筛选是根据重组克隆产生的新活性进行筛选,在工业上有很多重要的酶就是用这种方法发现的。其主要缺点是要在寄主中进行功能表达,造成筛选工作量大,效率低。化合物结构水平的筛选是根据不同结构的物质在色谱中有不同的峰值,通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构化合物的克隆子。此方法工作量大,费用高。序列驱动筛选是不依赖重组基因在宿主中表达来筛选,而是根据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物,通过杂交进行筛选具有目标序列的克隆子。底物诱导基因表达筛选是利用底物诱导克隆子分解代谢基因进行筛选,这种方法已经成功的从宏基因中筛选出芳烃化合物诱导的基因。国内外的资料显示这4种筛选方法可以筛选到所需要的物质,但筛选效率低,费用高。
3土壤宏基因组研究现状
利用宏基因组学的技术,科研人员筛选到了许多功能基因,加拿大TerraGenDiscover公司最先在以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到了具有抗菌活性的5种新的小分子物质TerragineA、B、C、D、E;Courtois等利用柯斯载体构建了含5000个克隆子的环境基因组文库,采用PCR序列分析的方法,筛选出编码聚酮合成酶的新基因,同时采用HPLC技术发现了脂肪二烯醇中2种新的化合物,两者互为同分异构体;Yun等选用pUC19为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库,利用活性筛选方法,从30000个重组子中筛选出1个含淀粉酶基因(amyM)的克隆子。
2005年,LimHK等以枯草芽孢杆菌为宿主,建立了森林土壤的宏基因组文库,筛选到2个具有抗菌活性的克隆,对其结构进行分析,得出其中一个为产红素的靛玉红,另一个为产蓝素的靛蓝,是靛玉红的异构体。2006年,VogetS等首次研究了从土壤宏基因组文库中筛选到的一种纤维素酶的性质,证实了其具有较广的pH值和温度适应范围,并且在较高的盐度时也具有活性,具有工业应用价值。
4土壤宏基因组学的技术局限性
总DNA提取技术尚存在一定的限制,土壤环境中,由于微生物与土壤颗粒紧密结合的特性以及腐殖酸等抑制性物质存在等原因,从中难以获得适于构建宏基因组文库的高分子量DNA。Bertrand等采用间接提取法,通过Nycodenz梯度离心,所回收的土壤DN段大小己能达到400kbp,但至今基于原位裂解获得>100kbp土壤DNA的提取技术尚未突破,运用原位裂解法构建更大片段环境宏基因组文库(现有的土壤宏基因组文库中,平均插人片段最大为44.5kb)仍是一个难点。不可避免地,环境宏基因组文库所包含微生物基因组信息的偏差将直接导致“基因遗漏”现象发生,如海洋中普遍存在的微生物固氮基因,却在测序量高达1.6Gbp的马尾藻海水宏基因组文库中被遗漏,表明仅运用宏基因组学技术同样会忽略部分的微生物资源。
人类基因组计划的成功实施与完成标志着基因组学的诞生,她是一门新兴起的生命科学边缘学科。以人类基因组测序完成为标志,基因组生物学的研究重点由结构基因组学转向以蛋白质组学为重要研究领域之一的功能基因组学。基因组学与蛋白质组学研究的实施与发展又孕育了生物信息学这一新兴交叉学科的产生与发展。基因组学、蛋白质组学、生物信息学是基因组生物学的非常重要的研究领域,它们的发展息息相关,相辅相成,且与人类起源、疾病(如癌症、肌营养不良症、家族遗传病等)预测诊断治疗、新药物新疫苗开发、生物武器鉴定、长寿与衰老死亡等许多方面有着重要关系,成为当今生命科学的热点与前沿。广义上,基因组学包含了结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学、生物信息学等方面的内容。因此,该课程是一门生物学前沿课程和交叉课程,对于丰富生物技术等相关专业学生知识面,完善知识结构和提高创新能力都有着重要影响。我就近几年来关于基因组学的教学实践谈几点体会,并对革新课堂教学模式进行了初步尝试。
一、教材
教材是一门课程的主要教学参考书,是确保教学过程系统性、规范性的关键,对教学效果有重要影响。基因组学是一门新兴起的生命科学边缘学科,我国许多高校的生物技术等相关专业课程设置中都将其设为专业限选课或选修课,如华中农业大学、天津医科大学、重庆邮电大学等。本课程也是我校生物技术专业的一门专业限选课。在考察了有关基因组研究的众多参考资料和兄弟院校的开课实际后,我们选了结构体系比较完整、内容深浅适宜、覆盖面较全的复旦大学杨金水编著的《基因组学(第二版)》(高等教育出版社,2007年)为主要教材。此外,选用了袁建刚等翻译的、BrownTA编著的《基因组2》(科学出版社,2006年)及其英文版原著Genomes2(BIOS Scientific Publishers Ltd)为重要参考教材。中英文对应的参考教材的使用更方便了学生对专业名词的理解和把握,有助于学生对专业英文文献的查阅和利用,便于跟踪学科前沿,扩充知识面,丰富学生视野。
二、教学内容
基因组学是从整体上对生物基因组中所有DNA进行测序、拼装和序列分析的一门科学,其研究对象涉及包括原核生物和真核生物在内的所有生命体。基因组测序的前提是进行基因组作图,包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱制作。测序后核苷酸序列分析主要是进行序列阐释,包括基因预测、各种类型重复序列鉴定与功能性MicroRNA的预测,等等。最后是进行各种功能性元件如基因、MicroRNA等功能分析。因此,基因组学的主要教学内容包括基因组的基本结构及组成,遗传图谱与物理图谱制作,基因组测序,基因组序列解读,基因组内基因的表达和调控,染色质的结构与基因表达调控,基因组活性的调控,不同生物基因组比较序列分析,基因组进化,等等,并结合当今基因组学研究的前沿进行有选择性的、重点的专题介绍,使学生不但能系统学习基因组学的必备知识,而且能对本学科发展方向及目前重大研究与突破有所了解,以丰富学生的相关知识并拓宽学生的知识面,为今后的就业与创业打下良好的基础。
三、教学方法
近年来我国多数高校本科各专业培养方案普遍采取的是多课程、少学时的模式,使多数课程学时严重不足[1-2]。就基因组学课程来讲,多数内容是生命科学研究的前沿与热点,而且对于多数本科生来说不容易理解和接受,这客观上需增加学时进行详细阐述。一方面教学大纲规定的学时严重不足,而另一方面教学实践上又确实需要增加学时来完成“解惑”的任务,怎样解决这一棘手的矛盾呢?这就需要根据学生已经学过的相关课程,对课程内容进行精选而且课程骨架知识体系又不被破坏,制定详细的教学计划,讲课方法根据内容进行有针对性选取,教学手段以多媒体辅助教学为主,并辅以必要的板书。
我在讲课实践中采取的是重点内容(如基因组作图与测序、功能基因组学中的表观遗传学部分、基因组进化中的端粒复制与基因组稳定性及基因组进化的机制与模式等)以讲授法为主,特别重要的知识点上辅以启示法、讨论法教学,如在讲到表观遗传学的座位控制区LCR(Locus Control Region)功能的内容时,我设计了图片(图1、2),在讲解时PPT演示按图1、2所示分步骤一一显示的,之后进行讨论,最后推而广之――研究一段待测DNA的功能时大都可以采取类似的方法。这样边讲解、边启示、边讨论,最后让学生自己总结出共性的东西的综合教学法,极大地提高了学生课堂参与的积极性、主动性和创造性,取得了很好的教学效果。期末,学生的成绩较好,而且学生对教学效果评价很高,达到优秀等次。
对于基因组学课程和分子生物学、生物化学等相关课程相交叉的内容,则以提问法为主要讲课手段,以将知识点前后贯通为主要目标进行教学,并适当加快教学进度。对于一些次要的、扩充性内容则以课堂讲授法为主,点到为止,但要求学生课下自读。对于一些最近发展起来的新技术、新方法、新领域,则以专题的形式进行教学,以1―4学时的时间为宜,并以国内外权威期刊杂志如《科学通报》、《中国农业科学》、Nature、Science、PNAS、Plant Cell等近几年尤其是近2年刊登的相关文章主要教学参考资料,确保专题教学的新颖性、权威性。
四、教学模式
教学模式是围绕教学目标在一定的教育思想指导下形成的相对稳定的教学范型,是人们在长期的教学实践中不断总结、改进而逐步形成的,对教学效果有着重要影响。[3]近些年来,随着新的教育教学思想不断涌现,以及人们对教育教学认识的不断深化,许多新的教学模式产生了,如愉快教学模式、自学辅导教学模式、探究研讨教学模式、主体性教学模式等。[4]虽然这些教学模式体现了新时期素质教育的要求,但仍拘泥于固定场所的课堂教学模式。
1969年,美国的神经病学教授Barrows在加拿大的McMaster大学创立了PBL教学模式,即以问题为学习基础(Problem-Based Learning,PBL)的教学模式[5]。PBL教学模式以具体疾病为基础,紧密结合临床实践,提倡以学生为中心、教师为引导的小组讨论式教学。其核心问题由多学科教学人员和相关临床专科人员共同设计,建立完善的学习模块,制定出某一病例的PBL手册,提供给各讨论小组。根据讨论的问题与学习深度的不同将教学分为初级、中级、高级三个水平,初级水平的病例为模拟的标准病人(Standard Patient,SP),中高级的病例则为真实病人(Real Patient,RP)。在教室或医院,由教师、学生、模拟病人(或真实病人)组成学习的虚拟或真实场景,进行三段讨论式教学,即提出问题,讨论自学建立假设,讨论自学解疑,论证假设。每一模块学习结束后进行测试、考核,最后进行总评。不难看出,与传统的知识传授型教学模式相比,PBL教学模式调动了学生主动学习的积极性,有利于提高学生的表达能力、沟通技巧和人际交流能力;有利于培养学生团队精神和协作能力;有利于培养学生的临床思维;PBL教学模式使实用性知识的传授更加得到重视;由于评估体系科学,能准确评估教学效果。目前,该教学模式已被世界上许多大学的医学专业教育所广泛采纳。
受该教学模式启发,我认为基因组学少部分教学内容可以进行专题讨论式教学模式探讨。具体来讲,就是首先与相关教师一块儿设计每一个专题的核心问题,并提出应达到的目标要求,带到课堂让学生讨论、发表意见,确定问题;之后,学生通过利用图书馆、网络、知识讲座等进行自学解疑,整理并写出问题的解决方法,再进行课堂交流、讨论;最后,通过讨论进行归纳总结。当通过课堂讨论提出核心问题之后,学生甚至可以分组到相关实验室参观学习,有条件的可以让学生参与部分科研工作,这样既可以让学生将理论与实践相结合,直接接触前沿课题研究实际,又可以减轻教师科研中一些简单的重复性劳动,提高科研设备的使用率。
五、结语
基因组学是伴随着人类基因组计划而诞生的一门新兴学科,是当今生命科学研究的前沿,与人类重大疾病分子机理、生物起源演化、新药物新疫苗开发等许多重要问题息息相关,对人类社会生活的许多方面都有重要影响。在我国许多高校的生物技术及其相关专业中基因组学是必开的一门课程,我就近几年来的基因组学授课实践经验进行了概括介绍,并就教学模式创新、改革提出了建议,希望能对兄弟院校相关专业学生的培样及相关课程的任课老师有所裨益。
参考文献:
[1]张琛.酶工程课程的教学方法的探讨与体会[J].科教文汇(上旬刊),2009,(1):223.
[2]梁红波,钟卫,熊磊.高分子物理课程的教学体会[J].高教论坛,2009,(1):80-81.
[3]方展勇.浅论课堂教学模式[J].广西教育学院学报,2001,(3):35-39.
【中图分类号】Q781
【文献标志码】A
宏基因组学认为,生命研究的对象应是生物环境中全部微小生物的基因组,即特定环境下所有生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌;因此,宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物群落研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。
利用宏基因组学技术研究口腔微生物,无需单一分离培养某一种类的微生物,即可直接在基因水平上研究口腔微生物,包括可培养和不可培养微生物。宏基因组学应用于口腔微生物的研究,主要包括两个方面:一方面进行微生物生态学研究,从整体微生物群落水平来研究口腔微生物,揭示口腔微生物群落多样性及其变化;另一方面是进行口腔微生物及其基因的研究,从中筛选到新的功能基因及其产物。通过这两方面的研究,较全面地了解口腔微生物的群落结构和功能基因组,为深入探索口腔微生物的代谢活动,最大限度地发掘口腔微生物资源提供可能。
1 宏基因组学的研究方法
宏基因组学是从特定环境中直接分离所有微生物的DNA,选择合适的载体用于克隆DN段,将DN段克隆到宿主细胞中进行表达,根据某些生物活或基因序列筛选有价值的克隆并进行其功能分析。
1.1宏基因组文库的构建
1.1.1环境微生物DNA的提取 环境样品DNA的提取是基因组文库构建中最重要的一步,不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来,而且还要保证一定的DN段长度和完整性。根据提取样品总DNA前是否需要分离细胞,可将其提取方法分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可直接破碎样品中的微生物细胞而使其DNA得以释放。原位裂解法无需对样品微生物进行复苏,黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表微生物的多样性。由于原位裂解法所提取的DN段仅为1~50kb,故其通常用于构建小片段插入文库(以质粒或入噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后以较温和的方法抽提其DNA。此法提取可以获得长度为20~500kb的大片段DNA,而且纯度高,但却容易丢失微生物物种信息。该方法适用于构建大片段插入文库(以黏粒或细菌人工载体为载体)的DNA提取。
1.1.2载体选择 目的基因能否有效地转入宿主细胞并在其中高表达,在很大程度上取决于载体。通常用于DNA克隆的载体包括质粒、黏粒和细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)等。质粒一般用于克隆小于10kb的DN段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒又称柯斯质粒或柯斯载体,用于克隆大片段的DNA分子,其克隆外源DN段的极限高达350kb,远远超过质粒载体的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DN段,最多可保存300kb个碱基对,转化率高,而且其以环状结构存在于细菌体内,易于分辨和分离纯化。另外,构建能容纳40kb外源DNA插入片段的fosmid文库也有报道。
1.1.3宿主选择 目前,常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。一些缺陷型突变体细菌也可以作为宿主进行宏基因组文库的功能筛选。宿主的选择主要应考虑其转化率和宏基因表达以及重组载体在宿主细胞中的稳定性和目标性状的筛选等。对于任何宏基因组来源的基因来说,大肠埃希菌依然是最理想的克隆和表达宿主。也可以用其他宿主菌,例如被用来鉴定与新抗生素生物合成相关基因的浅青紫链霉菌和一些革兰阴性细菌。也可以用穿梭黏粒或BAC载体将构建于大肠埃希菌的文库转入其他宿主,如链霉菌属或假单胞菌属中。根据不同微生物产生活性物质的差异和研究目标的不同,选择不同的宿主。随着技术的成熟和新宿主的选择,基因筛选率和功能基因检测率得以提高,进而宏基因组文库的目标基因的表达也得以提高。
1.2宏基因组文库的筛选
根据研究目的,宏基因组文库的筛选通常有功能筛选和序列筛选两种方法。功能筛选最常用方法是根据重组克隆产生一些酶蛋白功能活性,采用各种检测手段,挑选活性克隆子,得到完整的功能基因和带有目的基因的基因簇,发现全新的基因或活性物质。功能筛选首先要求功能基因或带有目的的基因簇在宿主中表达,但因其受到检测手段的限制,往往是在数千个甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆。序列筛选是依赖于目的基因的保守DNA序列,以序列相似性为基础,执行某类功能的酶可能具有相似的基因序列,根据已有的序列信息设计引物,进行PCR扩增或杂交筛选阳性克隆子。序列筛选一般只能获得结构基因的片段,而不能获得完整的功能基因;但是,它可以将扩增产物进行标志并将其作为探针筛选宏基因文库,以获得完整的功能基因。用这种方法有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子。
宏基因组文库的筛选除了功能筛选和序列筛选法外,还可以采用底物诱导基因表达法(sub-strate-induced gene expression,SIGEX)。SIGEX是以代谢相关基因或酶基因往往有底物存在的条件下才表达,反之则不表达的原理来筛选目的代谢基因的。SIGEX的优点在于它为高通量筛选提供了保障,而且不需要对底物进行修饰。
2 宏基因组学在口腔微生物研究领域中的应用
2.1口腔微生物群落结构分析
口腔是一个由大量微生物组成的复杂的生态系统,人类口腔中寄居着大约700多种细菌。人类口腔适宜的温度、湿度,丰富的营养来源,结构的复杂性和理化性质的不同,为口腔内各种微生物的生长、繁殖和定居提供了非常适宜的环境,因而也就造就了口腔微生物群的多样性。口腔微生物大部分可以相互关联并形成生物膜,抵抗机械清除力或抗生素治疗,但是在环境变化或其他口腔情况(如个人口腔卫生质量)变化触发时,它们也可成为致病微生物。
菌斑指示剂和传统培养方法以及常规的PCR特异性扩增的分子生物学方法在某种程度上都不能完整地反映整个微生物群落的组成和动态变化,不适合用其研究复杂的口腔微生物群落。此外,在难培养或不可培养的微生物当中,可能也有致病菌匿藏其中,因而也不能有效地用其研究与病程相关的微生物。
随着分子生物学和分子遗传学技术的发展,在基因组学的基础上诞生了宏基因组学这一门崭新的交叉学科。宏基因组学是继发明显微镜以来研究微生物最重要的进展,将为微生物世界带来革命性的突破。Turnbaugh等利用16S rRNA基因测序发现:胖人和瘦人的内脏中有着不同的微生物菌群;当胖人减肥的时候,他们内脏中的细菌群基因也同样发生变化,更加接近瘦人内脏中的细菌群。
基于常规的口腔细菌培养方法和细胞学显微镜检查,目前公认变异链球菌和乳酸杆菌等是引起龋病的主要致病菌;但是,随着宏基因组学在微生物的种类和多样性研究中的应用,有关龋病是由单一细菌引起或是由生物膜中的多种细菌引起的定论面临质疑。目前普遍认为,龋病并不是仅由变异链球菌或其他任何一种菌斑中的细菌单独引起的,而是由各种产酸菌相互作用的结果。
Aas等在对51名龋患者的1285个菌斑细菌的16S rRNA序列进行分析后发现,50%的细菌不能识别,一些新的细菌菌种与龋病的发生有关。Keijser等在用焦磷酸测序法分析健康人涎液和牙菌斑中细菌群时发现,口腔微生物具有多样性。即他们从98名健康成人口腔中取得的牙菌斑就由1万个微生物表型组成,其种族数远远超过之前报道的通过培养或者传统克隆和测序技术定义的700种口腔微生物表型。
Zaura等在利用焦磷酸测序技术检测了3名健康高加索人口腔内5个部位的微生物组后发现,在健康人的口腔中微生物有3600种独特物序列,超过500种不同的分类单元或“物种级”表型和88~104种高级分类群,每个单独的样品平均藏匿有266种分类单元。从这3名个体微生物组的测序结果分析可知,高级分类群、分类单元和独特序列都有一个较大的重叠,即84%的高级分类群、75%的分类单元和65%的独特序列至少在这3个微生物组中的2个组中存在。这3名个体的总共6315个独特序列中有1660个相同序列,这1660个相同序列,即“核心微生物组”贡献了66%的测序内容,重叠的分类单元贡献了94%的内容,而几乎所有的内容(99.8%)都属于共享的高级分类群。
研究证实,在不同的健康人的口腔微生物中,大部分微生物组是相同的,提示可能存在健康口腔核心微生物组。Kanasi等在对80名患龋和无龋婴幼儿牙菌斑微生物的16S rRNA序列克隆分析中发现,两者之间存在着139种不同微生物。Gross等通过酶促法测序技术对无龋和患龋年轻恒牙牙菌斑微生物的16S rRNA序列进行分析后认为,龋齿中产酸菌除了变异链球菌和乳酸杆菌外,月形单胞菌、奈瑟菌和缓症链球菌同样是潜在的产酸细菌。Willner等等在利用高通量测序技术检测了19名健康人口腔咽部的病毒宏基因组序列后发现,口腔咽部是一个潜在的被噬菌体T3侵蚀的肠道菌储存库。另外,他们还发现了编码血小板凝集因子PblA和PblB的两个寄生于变异链球菌中的噬菌体sm-1基因,而之前有研究称在心内膜上发现了变异链球菌。这说明,口腔中的病毒与心脏疾病存在潜在的联系。
宏基因组学技术可以避开传统的培养方法,在DNA水平来探讨口腔微生物群落结构及其与环境微生物的关系。微生物多样性在基因水平上主要表现为基因组大小和基因数目的多样性,遗传物质化学组成的多样性和某些特异性序列的差异。宏基因组技术为研究口腔微生物复杂群落和多样性提供了重要的技术手段,通过快速可靠地获得口腔微生物中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列,以系统分析口腔微生物的多样性及其分类地位,发掘丰富的口腔微生物资源。
2.2口腔微生物宏基因组文库中的新型基因筛选及其功能
宏基因组学除了研究微生物群落结构及其功能外,还可用于发现新的基因和开发新的微生物活性物质。Jiang等构建土壤宏基因文库,成功地克隆和鉴定出一种新型的β-葡萄糖苷酶基因,该基因包含一个由151个氨基酸编码组成的多肽。该研究对深入挖掘土壤未培养微生物的β-葡萄糖苷酶基因资源和该基因功能具有的重要意义。陈春岚等从富集培养物宏基因组文库中筛选出一个表达木聚糖酶基因umxyn10B,该基因大小为999bp,编码产物的氨基酸序列具有较好的同源性。对其功能进行研究发现,该酶具有优良的理化特性,可广泛应用于食品、能源、造纸和纺织等行业。Yu等利用宏基因功能筛选发现的两个新型低温活性酶脂EstM-N1和EstM-N2,属于细菌脂肪分解酶Ⅷ家族成员。这一发现将推动生物催化剂的应用。
中图分类号:R249 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2008)04-0826-02
证候是中医学的一个特有的概念,是辨证论治的核心和精髓。证候的标准化和定量化问题一直是中医学的一个棘手问题。在中医药学现代化的进程中,证候的现代化研究也被当作了中医药学现代化的突破点。随着现代基因组学和蛋白质组学的迅猛发展,中医学界正在掀起结合的浪潮,随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来为中医证候的研究带来了新的机遇,如何实现“证候-基因组学”阐释是目前中医药研究的热点。
1传统概念
证候是医者对病人的症状、舌脉、病情变化、治疗经过、个体情况、地土方宜等状况,经过四诊八纲的分析,采用某种辨证方法得出的一个总的概括性结论;是在疾病发展过程中的某一阶段的病理概括,可以认为证候是人体在疾病发展过程中的某一阶段的反应状态。证会随着疾病的进退而变化,是一个相对稳定的具有时间性、阶段性、变化性的概念。
2沈自尹院士认为的证研究难点
①证是一种功能态的,可以发展,可以转化;②证的概念应用亦较混乱,灵活性大,辨证可因人而异,只有凭医生的分析概括水平;③难以定性、定量、更难以定位。可见中医证的研究已成为影响中医药学发展的关键问题。证是一种有机综合的功能态,由一个调控中心及其所属的众多分子网络所构成,作为对外界反应与自我调节的基础。那么这个网络是什么呢?就是五脏网络系统。
3五脏网络系统
人的形体、脏腑、经脉、气穴、溪骨既有各自不同的功能,又彼此联系,内外相应、六合会通,共同发挥整体调控作用。这些联系从内环境来看,表现为脏与脏之间功能协同关系,脏与腑之间的表里关系,腑与腑之间的相互传化关系,脏腑与经络之间的相互络属关系,及脏腑与五官、五体、五液之间,脏腑与精、气、血、津液之间的互藏互用关系。从外环境看,表现为五脏系统与自然界之间的授受关系,与五音、五味、五季、五方的广泛联系,形成了以五行属性为纲的整个自然界的网络系统。五脏之间密切相关,每一脏都含有其他脏之气,而每一脏之气又都渗透到其他脏之中,调整着相互之间的关系。五脏之间相互依存,相互制约,每一脏的功能都再与它脏的交互联系中发挥作用。
五脏网络系统整体由心系统主宰,与其它各层次系统(子系统)的功能活动相互协调,使系统整体功能处于有序、协调和稳定状态。五脏功能网络并非机械的、自闭的,而是与时空联系在一起的。
4五脏网络系统与基因组网络系统
宏观整体和微观基因组整体有严密的同一性,宏观整体规律和微观基因组规律有同一性,宏观的五脏网络系统必然有微观的基因组网络系统相互对应。基因组整体由五脏基因组集团构成,脏基因组集团间的联系路线是经络系统的根源,五脏基因组依靠微观的经络系统的联系的相互作用形成了一个生命的统一体。
从证的机理来讲,证与五脏是密切相关的;从证与基因组的关系来讲,基因是里,证是表,证与基因的关系也是密切的,与基因组内部的功能作用路线是有关。中医辨证方法有八纲、六经、卫气营血、脏腑和三焦辨证等。而证又是有个体差异的,因而被认为与基因型相关。从基因组的角度讲,基因表达正常与协调为“正气”,反之为“病气”。1979年根据著名老中医关幼波的临床经验,将肝病分为8个主型,36个亚型。因而证的基因组定位也是有主次的,多点的,与基因组的微观经络系统、脏基因块及其作用调控途径有关。由证可以推出与某组蛋白质组有关,而这组蛋白质组又与某组基因组相关,因此可以推出肝脏基因组块的微细结构以及证的基因组机理。证候基因组定位是某些基因之间相互联系和表达量大小。证候的本质因此是某些基因组成的网络系统。
5证候-基因组研究
为促进中医药与现代生命科学的前沿―基因组学的沟通,寻求新的研究和发展领域与途径,国家中医药管理局科技教育司于1999 年3 月14-15 日在北京召开了中医药与基因组学研讨会。在中医药与基因组学研究相互渗透的可能性中医药与基因组学结合的研究领域、基因组学与中医药交叉渗透的切入点3个方面进行了广泛的交流,取得“证候-基因组”研究的共识。“证候-基因组学”定义为在证候理论指导下,运用功能基因组学的方法,通过探讨证候,特别是同病异证或异病同证时基因的变异及差异表达情况,揭示与某一证候形成相关的所有基因及其功能,从整体基因表达的水平阐明证候的本质。
“证候-基因组”的切入证候的研究也应当包含基因组的两个层次,即证候的单核苷酸多态研究和证候的基因表达谱研究。前者应从异病同证角度切入,这样才能发现与证候的关系密切的核苷酸多态,但是研究者要从整体上把握证候与SNP 的关系,就必须通过对全部一千万个SNP 位点都进行基因分型,其难度是相当大的。“证候-基因表达谱”研究主要针对参与表达的约3 万个基因,故从理论上把握证候的整体基因表达是可行的,因此目前“证候-基因组”研究以“证候-基因表达谱”为重点。
当代有许多中医学者专家比如王米渠先生在努力研究中医证候和基因组的结合,试图在基因组的研究中揭示出中医的证或者证候的本质。他们克服了方法论、试验重复性差、海量数据处理等困难,在证候-基因组研究中取得了可喜的一步,为揭示中医证候的本质为中医现代化作出了杰出贡献。
但是当代证候-基因组研究也存在许多的不足,例如:如何证候-基因表达谱动态中表现出证候的定量变化,基因组图谱中的基因相互关系怎样如何随着证的逐渐变化而发展的等等。将基因组图谱作为证候的本质不能说明问题,似乎有将中医走向还原论的可能,已经有许多学者提出了批评。
6证候-基因组研究的建议
证候-基因组研究作为证候现代化研究的初步,能作出这样的成果是不能提出任何批评的,但是为了进一步的发展不能不对现已经作出的成果和经验作出应有的总结和审核。
(1)重悟轻测是中医传统的认知方法,中医对人体生理、病理的认识体现了这一点。藏象系统就是通过直觉提出的。现在的证候-基因组研究看起来走向了另一极端,没有和中医原来的优点结合起来。笔者认为,证候-基因组研究应该和中医基因组学结合起来,将分析测定和整体思维直觉思维结合起来,达到悟测并重,在测定中结合整体思维,在整体思维中测定,相互验证。
(2)中医学在观察分析和研究处理问题时,注重的时事物的功能、属性、作用,而不是形态和结构。基因组整体时结构和功能的统一,认识基因组整体必须坚持功能分析和结构分析的统一,在实践中将二者结合起来,相互促进而快速达到目的。
(3)基因组是相互联系的整体,研究证候基因组必须从基因组整体出发,基因是整体中的部分,是全息性的部分,从整体出发才不会走向还原论,而保持中医的整体特色。
(4)中医坚持临床研究和试验研究的结合,证候是基因组的网络出现的不和谐的问题,临床有大量的证候都可以利用,可以在证候的研究中发现深刻的基因组联系;把临床研究与试验研究结合起来,相互弥补,利用各种分子生物学技术和手段可以发现基因组内的整体联系。
证候学是可以结合现代的分子生物学技术,阐述证候的整体本质,让中医学的整体色彩在新的时代重新焕发出新的光辉;否则就可能落后,随着生命本质的研究继续深入,中医学就可能被取代。基因组学是现代生命科学由还原论走向整体论的节点,而中医基因组学的建立不但促进这种趋势,而且可以促进中医药学的现代化发展。中医药学只有在结合吸收了现代科学的优秀还原论优势,在整体理论指导下分化重新整合而走向新的整体论高峰。
参考文献
早在20世纪50年代我们就知道遗传因素对药物反应的影响,典型的例子是蚕豆病,该病因遗传缺陷导致葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏,或活性低下,引起一系列生化代谢异常,一般情况下患者无症状,但在吃蚕豆或使用抗疟药伯氨喹啉类及其他具有强氧化作用的药物后就会出现急性溶血反应;再有就是异烟肼的乙酰化作用,因个体乙酰化速度不同,导致不同个体使用同等剂量异烟肼时出现疗效差异,甚或发生毒副反应的现象。20世纪90年代,药物基因组学的出现使我们对不同个体用药后的药物反应差异有了更深入了解,对很多以前难以解释的药物反应现象有了合理的解释,对指导临床合理用药也有了更加科学的依据。
1 药物基因组学的概念
药物基因组学是基因功能学与分子药理学的有机结合,是研究基因序列变异及其药物不同反应的科学,以药物效应及安全性为目标,运用已知的基因理论研究各种基因突变与药效及安全性的关系,药物基因组学强调个体化;通过它可为患者或者特定人群寻找合适的药物及恰当的剂量,改善病人的治疗效果。
2 药物基因组学的临床意义
药物基因组学的研究涉及储多药物,本文仅以以下两类药物的基因组学研究成果来表述基因组学对指导临床用药的意义。
2.1氨基糖苷类药物与耳聋
氨基糖苷类抗生素自1945年问世以来,因其杀菌作用强、抗菌谱较宽且价格低廉而在临床上广为应用,但其致耳聋的毒性反应也一直困扰着全世界的医生。我国有听力残疾2000万人,其中60%~80%为氨基糖苷类药物中毒所致。
氨基糖苷类抗生素致聋可分为两类,一类因接受了毒性剂量而致聋;另一类则与遗传因素相关。国内外学者均证实:线粒体基因第1555位点A-G的均值性点突变和氨基糖苷类诱导的耳聋关系非常密切。[1]即带有线粒体A1555G点突变基因,哪怕是仅接受常规剂量或仅一次接触氨基糖苷类即可致不可逆的听力损失。这类耳聋占全部氨基糖苷类抗生素致聋患者的30%左右。目前,我国已绘制出不同于西方国家的耳聋基因突变谱,也已开发出针对中国人的耳聋基因芯片检测体系。如能在新生儿出生时或出生后3天内采集脐带血或足跟血筛查聋病易感基因,[2]使易感基因携带者终生避免使用氨基糖苷类药物,则可避免“一针致聋”的悲剧。
2.2抗高血压药物的选择与剂量
原发性高血压的发生与环境因素(生活习惯、烟酒嗜好等)和遗传因素关系密切。目前,临床常用的抗高血压药可分为五类:利尿药、β-受体阻断药、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断药和钙通道阻滞药,大多数情况下医生制定治疗方案主要根据病人的年龄、体重、高血压程度、有无并发症等,凭经验、试验性地选择药物和药物剂量,较少考虑遗传因素,很多高血压病人虽已用药,但并未能取得满意疗效。药物基因组学的研究发现:抗高血压药物的疗效与药物遗传多态性有密切关系,如能在用药前测定病人的基因类型,有目的地选择药物和药物剂量,既可使疾病得到及时有效的治疗、减少不良反应的发生,也能减少医疗费用的支出。
早在20世纪50年代我们就知道遗传因素对药物反应的影响,典型的例子是蚕豆病,该病因遗传缺陷导致葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏,或活性低下,引起一系列生化代谢异常,一般情况下患者无症状,但在吃蚕豆或使用抗疟药伯氨喹啉类及其他具有强氧化作用的药物后就会出现急性溶血反应;再有就是异烟肼的乙酰化作用,因个体乙酰化速度不同,导致不同个体使用同等剂量异烟肼时出现疗效差异,甚或发生毒副反应的现象。20世纪90年代,药物基因组学的出现使我们对不同个体用药后的药物反应差异有了更深入了解,对很多以前难以解释的药物反应现象有了合理的解释,对指导临床合理用药也有了更加科学的依据。
1 药物基因组学的概念
药物基因组学是基因功能学与分子药理学的有机结合,是研究基因序列变异及其药物不同反应的科学,以药物效应及安全性为目标,运用已知的基因理论研究各种基因突变与药效及安全性的关系,药物基因组学强调个体化;通过它可为患者或者特定人群寻找合适的药物及恰当的剂量,改善病人的治疗效果。
2 药物基因组学的临床意义
药物基因组学的研究涉及储多药物,本文仅以以下两类药物的基因组学研究成果来表述基因组学对指导临床用药的意义。
2.1氨基糖苷类药物与耳聋
氨基糖苷类抗生素自1945年问世以来,因其杀菌作用强、抗菌谱较宽且价格低廉而在临床上广为应用,但其致耳聋的毒性反应也一直困扰着全世界的医生。我国有听力残疾2000万人,其中60%~80%为氨基糖苷类药物中毒所致。
氨基糖苷类抗生素致聋可分为两类,一类因接受了毒性剂量而致聋;另一类则与遗传因素相关。国内外学者均证实:线粒体基因第1555位点A-G的均值性点突变和氨基糖苷类诱导的耳聋关系非常密切。[1]即带有线粒体A1555G点突变基因,哪怕是仅接受常规剂量或仅一次接触氨基糖苷类即可致不可逆的听力损失。这类耳聋占全部氨基糖苷类抗生素致聋患者的30%左右。目前,我国已绘制出不同于西方国家的耳聋基因突变谱,也已开发出针对中国人的耳聋基因芯片检测体系。如能在新生儿出生时或出生后3天内采集脐带血或足跟血筛查聋病易感基因,[2]使易感基因携带者终生避免使用氨基糖苷类药物,则可避免“一针致聋”的悲剧。
2.2抗高血压药物的选择与剂量
原发性高血压的发生与环境因素(生活习惯、烟酒嗜好等)和遗传因素关系密切。目前,临床常用的抗高血压药可分为五类:利尿药、β-受体阻断药、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断药和钙通道阻滞药,大多数情况下医生制定治疗方案主要根据病人的年龄、体重、高血压程度、有无并发症等,凭经验、试验性地选择药物和药物剂量,较少考虑遗传因素,很多高血压病人虽已用药,但并未能取得满意疗效。药物基因组学的研究发现:抗高血压药物的疗效与药物遗传多态性有密切关系,如能在用药前测定病人的基因类型,有目的地选择药物和药物剂量,既可使疾病得到及时有效的治疗、减少不良反应的发生,也能减少医疗费用的支出。
2.2.1β-受体阻断药 β-受体阻断药通过降低交感神经功能产生降压作用。影响大部分β-受体阻断药代谢的酶是细胞色素P450酶(CYP)系中的CYP2D6,该酶具有遗传多态性,其基因变异可高度影响CYP2D6的活性。[3]CYP2D6可分为弱代谢型(PM)、中间代谢型(IM)、强代谢型(EM)和超强代谢型(UEM) 4种表型。PM的发生是由于CYP2D6基因突变造成酶活性的缺陷,此型患者代谢药物的能力下降,可导致血药浓度过高, 易诱发严重的不良反应如支气管哮喘、心血管疾病,甚至死亡,对此基因型病人,临床用药应减少药量。IM型者属于强代谢者中较弱的一部分,因基因突变导致酶活性略微降低,此类病人用药也应适当减少剂量。EM是正常人群的代谢表型,故临床上使用常规治疗剂量有效。UEM则是由于出现CYP2D6的多基因拷贝,使酶蛋白高度表达,导致酶活性的显著增高,此基因型代谢药物能力强,从而使血药浓度降低而达不到治疗效果,故应适当增加药量,[4]或改用其他药物。
药效学机制对β-受体阻断药反应的影响较药动学机制更为重要。体内β-受体的数量和受体对药物敏感性的变化是造成个体对β-受体阻断药反应差异的主要原因之一。[5]目前已知β1-受体存在两种突变, 一种位于受体蛋白N端49位,由甘氨酸取代丝氨酸(Ser49Gly),另一种位于C端389位,由甘氨酸取代精氨酸(Arg389Gly)。研究表明:突变型纯合子( Gly 49 及Gly389) 对β-受体阻断药反应都不及野生型。[4]也就是说,由于基因突变,导致患者对β-受体阻断药的敏感性下降;另一方面,遗传背景不同的种族对β-受体阻断药或激动药的敏感性也存在着差异,[5]这些差异都影响到β-受体阻断药临床应用时的剂量选择。
2.2.2噻嗪类利尿药 噻嗪类利尿药是最常用的基础降压药物,其降压原理是促进钠水排出,减少有效血容量,并扩张外周血管使血压下降。与噻嗪类利尿药降压作用个体差异相关的基因有:α-内收蛋白(α-adducin)、血管紧张素转换酶(ACE)的基因、G蛋白基因、编码WNK酶的基因,此外, NO酶、E298D 突变也与噻嗪类利尿药的降压效果有关。[4]
目前发现α-Adducin 具功能意义的突变为G460T,大量的研究表明, 含至少1个460T突变基因的患者使用利尿药的近期效应是血压(包括平均动脉压)下降幅度更大, 而远期效应则表现为相对其他降压药物而言更明显的降低心肌梗死和中风的发生率。[4]国内有学者[6]报道:ACE基因I/D多态性和氢氯噻嗪的降压作用密切相关,但目前研究结果还不太一致。有报道说:对同时携带ACE的I型等位基因及adducin的Trp460等位基因的患者氢氯噻嗪的疗效最好,而携带ACE的D/D等位基因及adducin的Gly/Trp等位基因的患者用氢氯噻嗪治疗后血压下降最少,[7]所以临床用药时如能联合分析ACE和α-adducin两方面的基因多态性,则有助于预测利尿剂的疗效。
2.2.3血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI) ACEI的降压作用主要通过抑制周围和组织中的ACE,使血管紧张素II生成减少,同时抑制缓激肽酶使缓激肽降解减少,而达到降压目的。ACEI与基因多态性关系的研究主要集中在RAAS,多态位点包括ACE基因I/D、AGT基因M235T和血管紧张素II- I型受体(AT1R)基因A1166C。[8]其中研究最广泛的是ACE基因I/D多态性,用卡托普利、依那普利、赖诺普利和培垛普利研究ACEI抗高血压的疗效,研究结果并不一致,说明:原发性高血压患者对ACEI类药物反应的差异部分由遗传因素决定。有人发现AT1基因多态性(A1166C)与ACEI类药物的降压疗效相关,且此相关性在老年患者和超体重患者中尤为明显。[7]
2.2.4血管紧张素Ⅱ受体阻滞药 沙坦类降压药主要通过阻滞血管紧张素Ⅱ受体,降低外周血管阻力,产生降压作用。沙坦类药物在体内主要依靠CYP2C9代谢, 该基因突变使酶活性明显下降,毒性增加, 疗效降低。另外, CYP11B2 的多态性被证实与血管紧张素Ⅱ受体阻滞药的降压效果相关,该基因突变引起机体对血管紧张素Ⅱ受体阻滞药敏感性增加, 表现为收缩压下降较无突变型明显。[4]
2.2.5钙通道阻滞药(CCI) 钙通道阻滞药是近30年来广泛应用于临床的一类治疗心血管疾病的药物,通过阻滞钙离子L通道, 抑制血管平滑肌及心肌钙离子内流, 从而使血管平滑肌松弛心肌收缩力降低, 使血压下降。钙通道阻滞药在体内的代谢主要依靠CYP3A,该基因突变可引起CYP3A酶活性下降,可导致体内血药浓度增加, 药物的毒性也相应增加, 故应适当减少药物的用量。[4]
3 展望
药物基因组学经过十几年的发展,在药物代谢、转运和药理作用的基因多态性的研究有很大的进展。在有些药物上有重大突破,如氨基糖苷类的耳聋问题,但更多的药物研究还都处在起步阶段,有待于更加深入的研究。相信随着病理、药理机制研究的深入、药物基因组学研究方法及新技术的不断的完善,以及个体化用药基因芯片的研发,不久的将来,很多药物都可以实现以基因为导向、“量体裁衣”式的个体化用药治疗模式,使临床用药更具针对性、高效性和安全性,实现治疗学上按基因选药的个体化用药的飞跃。 参 考 文 献
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[3]樊晓寒,惠汝太.β受体阻滞剂药物基因组学研究进展[J].中华心血管病杂志,2006. 34(10)947-950.
[4]唐强,刘海玲,刘昭前.抗高血压药物的基因组学研究进展[J].中南药学,2007.5(2)157-160.
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基因多态性是药物基因组学的研究基础。药物效应基因所编码的酶、受体、离子通道作为药物作用的靶,是药物基因组学研究的关键所在。基因多态性可通过药物代谢动力学和药物效应动力学改变来影响物的作用。
基因多态性对药代动力学的影响主要是通过相应编码的药物代谢酶及药物转运蛋白等的改变而影响药物的吸收、分布、转运、代谢和生物转化等方面。与物代谢有关的酶有很多,其中对细胞色素-P450家族与丁酰胆碱酯酶的研究较多。基因多态性对药效动力学的影响主要是受体蛋白编码基因的多态性使个体对药物敏感性发生差异。
苯二氮卓类药与基因多态性:咪唑安定由CYP3A代谢,不同个体对咪唑安定的清除率可有五倍的差异。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代谢,基因的差异在临床上可表现为用药后镇静时间的延长。
吸入与基因多态性:RYR1基因变异与MH密切相关,现在已知至少有23种不同的RYR1基因多态性与MH有关。氟烷性肝炎可能源于机体对在CYP2E1作用下产生的氟烷代谢产物的一种免疫反应。
神经肌肉阻滞药与基因多态性:丁酰胆碱酯酶是水解琥珀酰胆碱和美维库铵的酶,已发现该酶超过40种的基因多态性,其中最常见的是被称为非典型的(A)变异体,与用药后长时间窒息有关。
镇痛药物与基因多态性:μ-阿片受体是阿片类药的主要作用部位,常见的基因多态性是A118G和G2172T。可待因和曲马多通过CYP2D6代谢。此外,美沙酮的代谢还受CYP3A4的作用。儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)基因与痛觉的产生有关。
局部与基因多态性:罗哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代谢。CYP1A2的基因多态性主要是C734T和G2964A,可能影响药物代谢速度。
一直以来麻醉科医生较其它专业的医疗人员更能意识到不同个体对药物的反应存在差异。的药物基因组学研究将不仅更加合理的解释药效与不良反应的个体差异,更重要的是在用药前就可以根据病人的遗传特征选择最有效而副作用最小的药物种类和剂型,达到真正的个体化用药。
能够准确预测病人对麻醉及镇痛药物的反应,一直是广大麻醉科医生追求的目标之一。若能了解药物基因组学的基本原理,掌握用药的个体化原则,就有可能根据病人的不同基因组学特性合理用药,达到提高药效,降低毒性,防止不良反应的目的。本文对药物基因组学的基本概念和常用的药物基因组学研究进展进行综述。
一、概述
二十世纪60年代对临床麻醉过程中应用琥珀酰胆碱后长时间窒息、硫喷妥钠诱发卟啉症及恶性高热等的研究促进了药物遗传学(Pharmacogenetics)的形成和发展,可以说这门学科最早的研究就是从麻醉学开始的。
药物基因组学(Phamacogenomics)是伴随人类基因组学研究的迅猛发展而开辟的药物遗传学研究的新领域,主要阐明药物代谢、药物转运和药物靶分子的基因多态性及药物作用包括疗效和毒副作用之间的关系。它是以提高药物的疗效及安全性为目标,研究影响药物吸收、转运、代谢、消除等个体差异的基因特性,以及基因变异所致的不同病人对药物的不同反应,并由此开发新的药物和用药方法的科学。
1959年Vogel提出了“药物遗传学”,1997年Marshall提出“药物基因组学”。药物基因组学是药物遗传学的延伸和发展,两者的研究方法和范畴有颇多相似之处,都是研究基因的遗传变异与药物反应关系的学科。但药物遗传学主要集中于研究单基因变异,特别是药物代谢酶基因变异对药物作用的影响;而药物基因组学除覆盖药物遗传学研究范畴外,还包括与药物反应有关的所有遗传学标志,药物代谢靶受体或疾病发生链上诸多环节,所以研究领域更为广泛[1,2,3]。
二、基本概念
1.分子生物学基本概念
基因是一个遗传密码单位,由位于一条染色体(即一条长DNA分子和与其相关的蛋白)上特定位置的一段DNA序列组成。等位基因是位于染色体单一基因座位上的、两种或两种以上不同形式基因中的一种。人类基因或等位基因变异最常见的类型是单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)。目前为止,已经鉴定出13000000多种SNPs。突变和多态性常可互换使用,但一般来说,突变是指低于1%的群体发生的变异,而多态性是高于1%的群体发生的变异。
2.基因多态性的命名法:
(1)数字前面的字母代表该基因座上最常见的核苷酸(即野生型),而数字后的字母则代表突变的核苷酸。例如:μ阿片受体基因A118G指的是在118碱基对上的腺嘌呤核苷酸(A)被鸟嘌呤核苷酸(G)取代,也可写成118A/G或118A>G。
(2)对于单个基因密码子导致氨基酸转换的多态性编码也可以用相互转换的氨基酸的来标记。例如:丁酰胆碱酯酶基因多态性Asp70Gly是指此蛋白质中第70个氨基酸-甘氨酸被天冬氨酸取代。
三、药物基因组学的研究内容
基因多态性是药物基因组学的研究基础。药物效应基因所编码的酶、受体、离子通道及基因本身作为药物作用的靶,是药物基因组学研究的关键所在。这些基因编码蛋白大致可分为三大类:药物代谢酶、药物作用靶点、药物转运蛋白等。其中研究最为深入的是物与药物代谢酶CYP45O酶系基因多态性的相关性[1,2,3]。
基因多态性可通过药物代谢动力学和药物效应动力学改变来影响药物作用,对于临床较常用的、治疗剂量范围较窄的、替代药物较少的物尤其需引起临床重视。
(一)基因多态性对药物代谢动力学的影响
基因多态性对药物代谢动力学
的影响主要是通过相应编码的药物代谢酶及药物转运蛋白等的改变而影响药物的吸收、分布、转运、代谢和生物转化等方面[3,4,5,6]。
1、药物代谢酶
与物代谢有关的酶有很多,其中对细胞色素-P450家族与丁酰胆碱酯酶的研究较多。
(1)细胞色素P-450(CYP45O)
物绝大部分在肝脏进行生物转化,参与反应的主要酶类是由一个庞大基因家族编码控制的细胞色素P450的氧化酶系统,其主要成分是细胞色素P-450(CYP45O)。CYP45O组成复杂,受基因多态性影响,称为CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反应CYP45O基因超家族内的进化关系的统一命名法:凡CYP45O基因表达的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的视为同一家族(Family),以CYP后标阿拉伯数字表示,如CYP2;氨基酸同源性大于55%为同一亚族(Subfamily),在家族表达后面加一大写字母,如CYP2D;每一亚族中的单个变化则在表达式后加上一个阿拉伯数字,如CYP2D6。
(2)丁酰胆碱酯酶
麻醉过程中常用短效肌松剂美维库铵和琥珀酰胆碱,其作用时限依赖于水解速度。血浆中丁酰胆碱酯酶(假性胆碱酯酶)是水解这两种药物的酶,它的基因变异会使肌肉麻痹持续时间在个体间出现显著差异。
2、药物转运蛋白的多态性
转运蛋白控制药物的摄取、分布和排除。P-糖蛋白参与很多药物的能量依赖性跨膜转运,包括一些止吐药、镇痛药和抗心律失常药等。P-糖蛋白由多药耐药基因(MDR1)编码。不同个体间P-糖蛋白的表达差别明显,MDR1基因的数种SNPs已经被证实,但其对临床麻醉的意义还不清楚。
(二)基因多态性对药物效应动力学的影响
物的受体(药物靶点)蛋白编码基因的多态性有可能引起个体对许多药物敏感性的差异,产生不同的药物效应和毒性反应[7,8]。
1、蓝尼定受体-1(Ryanodinereceptor-1,RYR1)
蓝尼定受体-1是一种骨骼肌的钙离子通道蛋白,参与骨骼肌的收缩过程。恶性高热(malignanthyperthermia,MH)是一种具有家族遗传性的、由于RYR1基因异常而导致RYR1存在缺陷的亚临床肌肉病,在挥发性吸入和琥珀酰胆碱的触发下可以出现骨骼肌异常高代谢状态,以至导致患者死亡。
2、阿片受体
μ-阿片受体由OPRM1基因编码,是临床使用的大部分阿片类药物的主要作用位点。OPRM1基因的多态性在启动子、内含子和编码区均有发生,可引起受体蛋白的改变。吗啡和其它阿片类药物与μ-受体结合而产生镇痛、镇静及呼吸抑制。不同个体之间μ-阿片受体基因的表达水平有差异,对疼痛刺激的反应也有差异,对阿片药物的反应也不同。
3、GABAA和NMDA受体
γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体是递质门控离子通道,能够调节多种物的效应。GABAA受体的亚单位(α、β、γ、δ、ε和θ)的编码基因存在多态性(尤其α和β),可能与孤独症、酒精依赖、癫痫及精神分裂症有关,但尚未见与物敏感性有关的报道。N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的多态性也有报道,但尚未发现与之相关的疾病。
(三)基因多态性对其它调节因子的影响
有些蛋白既不是药物作用的直接靶点,也不影响药代和药效动力学,但其编码基因的多态性在某些特定情况下会改变个体对药物的反应。例如,载脂蛋白E基因的遗传多态性可以影响羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(他汀类药物)的治疗反应。鲜红色头发的出现几乎都是黑皮质素-1受体(MC1R)基因突变的结果。MC1R基因敲除的老鼠对的需求量增加。先天红发妇女对地氟醚的需要量增加,热痛敏上升而局麻效力减弱。
四、苯二氮卓类药与基因多态性
大多数苯二氮卓类药经肝脏CYP45O代谢形成极性代谢物,由胆汁或尿液排出。常用的苯二氮卓类药物咪唑安定就是由CYP3A代谢,其代谢产物主要是1-羟基咪唑安定,其次是4-羟基咪唑安定。在体实验显示不同个体咪唑安定的清除率可有五倍的差异。
地西泮是另一种常用的苯二氮卓类镇静药,由CYP2C19和CYP2D6代谢。细胞色素CYP2C19的G681A多态性中A等位基因纯合子个体与正常等位基因G纯合子个体相比,地西泮的半衰期延长4倍,可能是CYP2C19的代谢活性明显降低的原因。A等位基因杂合子个体对地西泮代谢的半衰期介于两者之间。这些基因的差异在临床上表现为地西泮用药后镇静或意识消失的时间延长[9,10]。
五、吸入与基因多态性
到目前为止,吸入的药物基因组学研究主要集中于寻找引起药物副反应的遗传方面的原因,其中研究最多的是MH。药物基因组学研究发现RYR1基因变异与MH密切相关,现在已知至少有23种不同的RYR1基因多态性与MH有关。
与MH不同,氟烷性肝炎可能源于机体对在CYP2E1作用下产生的氟烷代谢产物的一种免疫反应,但其发生机制还不十分清楚[7,11]。
六、神经肌肉阻滞药与基因多态性
神经肌肉阻滞药如琥珀酰胆碱和美维库铵的作用与遗传因素密切相关。血浆中丁酰胆碱酯酶(假性胆碱酯酶)是一种水解这两种药物的酶,已发现该酶超过40种的基因多态性,其中最常见的是被称为非典型的(A)变异体,其第70位发生点突变而导致一个氨基酸的改变,与应用肌松剂后长时间窒息有关。如果丁酰胆碱酯酶Asp70Gly多态性杂合子(单个等位基因)表达,会导致胆碱酯酶活性降低,药物作用时间通常会延长3~8倍;而丁酰胆碱酯酶Asp70Gly多态性的纯合子(2个等位基因)表达则更加延长其恢复时间,比正常人增加60倍。法国的一项研究表明,应用多聚酶链反应(PCR)方法,16例发生过窒息延长的病人中13例被检测为A变异体阳性。预先了解丁酰胆碱酯酶基因型的改变,避免这些药物的应用可以缩短术后恢复时间和降低医疗费用[6,12]。
七、镇痛药物与基因多态性
μ-阿片受体是临床应用的阿片类药的主要作用部位。5%~10%的高加索人存在两种常见μ-阿片受体基因变异,即A118G和G2172T。A118G变异型使阿片药物的镇痛效力减弱。另一种阿片相关效应—瞳孔缩小,在118G携带者明显减弱。多态性还可影响阿片类药物
代谢。
阿片类药物的重要的代谢酶是CYP2D6。可待因通过CYP2D6转化为它的活性代谢产物-吗啡,从而发挥镇痛作用。对33名曾使用过曲马多的死者进行尸检发现,CYP2D6等位基因表达的数量与曲马多和O-和N-去甲基曲马多的血浆浓度比值密切相关,说明其代谢速度受CYP2D6多态性的影响。除CYP2D6外,美沙酮的代谢还受CYP3A4的作用。已证实CYP3A4在其它阿片类药如芬太尼、阿芬太尼和苏芬太尼的代谢方面也发挥重要作用。
有报道显示儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)基因与痛觉的产生有关。COMT是儿茶酚胺代谢的重要介质,也是痛觉传导通路上肾上腺素能和多巴胺能神经的调控因子。研究证实Val158MetCOMT基因多态性可以使该酶的活性下降3~4倍。Zubieta等报道,G1947A多态性个体对实验性疼痛的耐受性较差,μ-阿片受体密度增加,内源性脑啡肽水平降低[13~16]。
八、局部与基因多态性
罗哌卡因是一种新型的酰胺类局麻药,有特有的S-(-)-S对应体,主要经肝脏代谢消除。罗哌卡因代谢产物3-OH-罗哌卡因由CYP1A2代谢生成,而4-OH-罗哌卡因、2-OH-罗哌卡因和2-6-pipecoloxylidide(PPX)则主要由CYP3A4代谢生成。CYP1A2的基因多态性主要是C734T和G2964A。Mendoza等对159例墨西哥人的DNA进行检测,发现CYP1A2基因的突变率为43%。Murayama等发现日本人中CYP1A2基因存在6种导致氨基酸替换的SNPs。这些发现可能对药物代谢动力学的研究、个体化用药具有重要意义[17,18,19]。