酒席致谢词汇总十篇

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篇（1）

中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0027-04

Preliminary Study on Bioactivity of Myxobacterium So ce shu-1 and Its Secondary Metabolites

LI Yan-li1, ZHANG Yin-lei2, LIU Ying, MA Zhong-liang2*

(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Bioenergy Crops, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Abstract：Objective To study the bioactivity of myxobacterium So ce shu-1 and its secondary metabolites which can be separately obtained. Methods The oven-drying method and DNS method were used to determine the cellulose-utilizing capability of So ce shu-1. The antibacterial and antitumor effects of the secondary metabolites of So ce shu-1 were investigated by filter paper method and MTT method, respectively. Results So ce shu-1 could use the cellulose from cornstalk and filter paper, and its cellulase activity was 12.30 UFPA/mL. The secondary metabolites of So ce shu-1 had broad-spectrum antimicrobial activity and could effectively inhibit the growth of tumor cells, especially inhibiting K562 cell line. Conclusion So ce shu-1 can be used in energy development and its secondary metabolites have a bright development perspective in drug and food fresh-keeping.

Key words：myxobacterium; secondary metabolite; bioactivity

目前已从黏细菌中发现约600多种生物活性物质，约占微生物来源总数的5 %。黏细菌产生的生物活性物质种类繁多，结构新颖，作用层次多，作用机制多样等。这些次级代谢物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、抗高血压、抗糖尿病、抗疟疾以及抗高胆固醇症等特性。抗生素产生菌比例高于放线菌，现已成为生物活性物质的新微生物来源[1,2]，如epo系列的抗肿瘤药物，比传统抗肿瘤药物紫杉醇具有更多的优点[3]。某些黏细菌能利用纤维素，为将纤维素（农作物废弃物的主要成分）转化为生物燃料提供了新的选择。因此，黏细菌在能源综合利用及其次级代谢物在食品、医药工业的应用上都值得深入研究。我们现从这两方面对分离到的黏细菌进行了初步研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和细胞黏细菌：So ce shu-1 按中国药科大学生命科学学院报道的方法分离[4]。测试菌株：大肠杆菌（ Escherichia coli DH 5α）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、耐药金葡菌[Staphyloccocus aureus atcc 29213(耐药菌株)]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、短小杆菌（Corynbacterium parυm）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、伤寒杆菌（Salmonella typhi）、副乙伤寒杆菌（Salmonella paratyphi B）由本校微生物学教研室保存。肿瘤细胞株：HeLa、KB、K562以及SGC7901肿瘤细胞均购自上海生化细胞所。

1.1.2培养基发酵培养基（g/L）：KNO3 1.0；K2HPO4・2H2O 1.0；MgSO4・7H2O 1.0；CaCl2 1.0；FeCl3・6H2O 0.2，酵母提取物10 g；加入放线菌酮（0.1 %），pH 7.2。固体培养基：在发酵培养基中按10 g/L加入琼脂。

1.2方法

1.2.1降解纤维素（1）将培养基分装于试管，新华一号滤纸剪成约0.5 cm×5 cm 的长条，部分露于培养基液面外。接种So ce shu-1至培养基中，以不接种者为空白对照。

（2）从平板上接种菌种至3 mL液体选择培养基上，37 ℃摇床培养1 d，成为种子菌液；取10 ％种子菌液转入25 mL培养基中，37 ℃摇床培养至菌液A600为0.3；再加入2 000 g玉米秸秆粉，配制成半固体状，37 ℃培养1 d。培养后的混合物过滤取不溶物，烘干，称重计算秸秆降解率［5］。

1.2.2黏细菌纤维素酶活性――滤纸酶活性（FPA）的测定[6]以新华滤纸为底物，加入1.0 mL适当稀释的纤维素酶溶液，在特定pH值下，50 ℃反应1 h，用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定反应生成的还原糖[7]。1个滤纸酶活性单位（1 UFPA）定义为上述条件下每1 h由底物产生1.0 mg还原糖所需的酶量，用U/mL表示。

1.2.3次级代谢物的分离及抑菌测定分离次级代谢物的方法按文献[4]，抑菌实验用滤纸法[8]。向培养皿倾倒含菌培养基，铺置滤纸片，在滤纸片上滴加一定量的次级代谢物提取液，培养并测量形成的抑菌圈。以吸取蒸馏水的滤纸片为空白对照。

1.2.4次级代谢物的细胞毒实验用溴化四唑蓝（MTT）法[9]。

2结果

2.1测定黏细菌So ce shu-1对纤维素的水解

2.1.1So ce shu-1对滤纸的利用培养2周后，So ce shu-1使滤纸变薄，纤维素分解反应呈阳性，表明So ce shu-1可利用纤维素作为碳源。

2.1.2So ce shu-1对秸秆的利用So ce shu-1与秸秆共培养后，经烘干称重，玉米秸秆干重减少0.310 g， 降解率为15.50 ％。

2.2纤维素酶活性的测定

培养液中纤维素酶的酶活性为 12.30 UFPA/mL。

2.3次级代谢物的抑菌作用

2.3.1抑菌谱的测定So ce shu-1次级代谢物抑制受试细菌的结果见表1。

由表1可见，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对大部分受试细菌有明显的抑制作用，即具有广谱抗菌作用。

2.3.2抑制大肠杆菌的效果不同浓度的次级代谢物抑制大肠杆菌的结果见表2。

由表2可见，随So ce shu-1次级代谢物量的增加，抑菌圈直径增大，抑菌效果更加明显，在一定范围内呈浓度依赖性。

2.4次级代谢物对K562肿瘤细胞株的细胞毒作用

So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞株作用24，48，72 h后，其对K562肿瘤细胞的抑制率见图1。

由图1可见，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞株有很好的抑制作用。药物浓度小于0.121 mg/mL时，抑制率随药物浓度增加而迅速增加，增幅明显；药物浓度大于0.121 mg/mL时，抑制率随药物浓度增加呈增加趋势，但增幅趋于平缓；药物作用时间越长，抑制效果越明显，72 h的抑制效果明显优于48 h和24 h。肿瘤细胞24 h后的抑制效果见图2。

由图2可见，给药24 h后，细胞形态发生很大变化，细胞萎缩呈球状，黯淡无光泽，数量较稀疏，甚至出现细胞破裂溶出现象（A）；对照组细胞饱满、有光泽（B）。

So ce shu-1次级代谢物作用于其他肿瘤细胞株以及与K562的比较见表3。

由表3可见，黏细菌的次级代谢物对多种肿瘤细胞均有抑制作用，抑制效果随作用时间的延长而增强，与对K562的抑制效果类似。表明，黏细菌So ce shu-1次级代谢物对不同的肿瘤细胞株也有抑制作用，有明显的时间依赖性。

3讨论

能源问题是目前全世界面临的重大课题，研究表明，黏细菌尤其是嗜纤维素的黏细菌能够利用纤维素，这为木质纤维素转化为能源提供了一大类新的微生物来源。我们初步研究的结果表明，分离所得的黏细菌确能降解玉米秸秆。此菌株降解秸秆的机制有待进一步研究，菌株降解条件也有待优化，以能更好的利用能源。

文献报道黏细菌次级代谢物对大多真菌有一定的抑制作用，对细菌特别是革兰阴性菌基本没有抑制作用[10,11]，而本研究表明So ce shu-1次级代谢物对革兰阳性菌和阴性菌均有很好的抑制效果。我们发现，So ce shu-1次级代谢物对大肠杆菌的抑制效果不仅明显，而且可维持较长时间，出现抑菌圈6 d后仍未消失。尚无文献报道黏细菌代谢物抑制大肠杆菌的效果[12,13]，提示该粗提物中可能存在新活性物质，有潜在的开发利用前景。

黏细菌So ce shu-1次级代谢物对K562肿瘤细胞有较好抑制效果，我们还用其他肿瘤细胞如HeLa、KB和SGC7901做了实验，结果表明次级代谢物对肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用。此外，该菌的次级代谢物对MDA-MB-231和SMMC7721也有一定的抑制作用（数据未显示），表明它具有广谱抗肿瘤细胞活性；此菌的次级代谢物抑菌谱中，抑制菌多数为致病菌。从抑菌和抗肿瘤两个方面的研究表明，此菌的次级代谢物在药物和食品保鲜方面有很好的应用前景。

参考文献

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篇（2）

[收稿日期] 2013-12-20

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81130070，81072989）； 国家科技支撑计划项目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] 郭兰萍，Tel：（010） 64011944，E-mail： glp01@126. com

[作者简介] 黄蕾，E-mail：

欧洲花楸Sorbus aucuparia L.为蔷薇科苹果亚科花楸属落叶乔木或小乔木，原产欧洲和亚洲西部温带高山区域[1]，其干燥成熟果实可食用和入药[2]。我国花楸属植物50余种，资源丰富，供药用者约6种[2]。目前研究发现，苹果亚科植物受到外界病原菌侵害时特异性地产生联苯类化合物作为植保素[3]，Kokubun T等使用铜离子处理欧洲花楸叶片后，可以从叶片中分离出欧花楸素[4]，这种联苯类化合物在健康的植株中并不存在，且其具有广泛的生物活性。欧洲花楸是集药用、食用、园林和生态价值于一身的珍贵树种。

欧洲花楸悬浮细胞（SASC）生长速度快、周期短，可作为很好的研究材料[5]，已有研究发现用酵母提取物（YE）作为诱导子处理可使SASC迅速合成联苯类化合物[6]。但是，目前这类具有植保素作用的化合物合成机制尚不明确，还有待进一步的研究。

本实验以SASC为材料，通过检测YE处理后SASC次生代谢产物的变化及其细胞培养液中pH、可溶性蛋白含量、细胞外Ca2+流等生理生化指标的变化，初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制，尤其是从可溶性蛋白和钙离子2个方面为机制研究提供了很好的思路和方向，为更深层次地研究打下基础。

1 材料

欧洲花楸悬浮细胞系由中国科学院植物研究所叶和春研究员赠送。

培养箱（Conviron Adaptis CMP6010）；超大型摇床（ZYSA0351）；电子天平（Sartorius BS 2202S）；超净工作台（SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台）；分析型酸度计（JENWAY3510）；高效液相仪（Waters 2695_2996）；UV检测器（T6新世纪19-1650-01-1169）；液质联用仪（Agilent 6320 Ion Trap）；其他常规设备。

牛血清蛋白为美国MP公司产品；Yeast extract为OXOID公司产品；其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。

2 方法

2.1 细胞悬浮培养体系的建立 诱导出的欧洲花楸愈伤组织接种于含50 mL MS固体培养基的400 mL广口瓶中，愈伤组织每 14 d 继代1次，经过3～5次继代后，选择疏松的愈伤组织转入液体培养基中培养，每 250 mL 三角瓶中分装 50 mL 的液体培养基，置于25 ℃培养箱中暗培养。悬浮细胞培养转速设定为 120 r・min-1。实验中使用的欧洲花楸悬浮细胞是将减压过滤后的 1.4 g细胞接种于含有 20 mL MS液体培养基的100 mL 三角瓶中。

2.2 YE诱导子的配制及处理 用蒸馏水溶解酵母提取物，配制60 g・L-1的母液，高压灭菌。参照Liu B等处理方法[6]，处理终浓度为3 g・L-1。

2.3 欧洲花楸悬浮细胞中次生代谢产物的提取和检测 将收获的细胞用15 mL甲醇在研钵中研碎，使用滤纸和漏斗将滤液过滤到鸡心瓶中，过滤后的细胞残渣再用10 mL甲醇提取1次，合并滤液，将鸡心瓶置于旋转蒸发仪上浓缩至干。培养基用15 mL乙酸乙酯萃取2次，用分液漏斗分离，将乙酸乙酯层倒入提取细胞后的鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上浓缩至干。用1 mL的乙酸乙酯定容。

将提取液中的乙酸乙酯溶液挥干，用500 μL的色谱甲醇溶解，过0.22 μm的有机滤膜后用于HPLC检测。

HPLC测定条件为：液相色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水-甲醇（50∶50）流速0.7 mL・min-1；紫外检测波长为280 nm。

质谱条件为：离子源为ESI；正离子模式；雾化气压力206.85 kPa；干燥气为氮气，干燥气温度300 ℃，流速10 L・min-1；毛细管电压4 000 V；相对分子质量扫描范围100～600；柱尾分流 2∶1。

2.4 欧洲花楸悬浮细胞生物量测定 将培养的悬浮细胞真空抽滤至不滴水后，直接称量细胞鲜重即为生物量，用鲜重（FW）表示，每个处理设置4个生物学重复。

2.5 细胞悬浮液pH测定 采用分析型酸度计直接测定培养基中的pH，每个处理设置4个生物学重复。

2.6 细胞中可溶性蛋白质含量的测定 用考马斯亮蓝G-250法测定[7]，以牛血清蛋白作标准曲线，单位为mg・g-1（鲜重），每个处理设置4个生物学重复。

2.7 细胞外Ca2+流变化的测定 采用非损伤微测技术（NMT）[8]，用多聚赖氨酸玻片固定细胞，加入测试液稳定15 min，在显微镜下找到直径约200 μm的细胞簇，测定时间为10 min，每个处理设置5个生物学重复。

3 结果与分析

3.1 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞次生代谢产物的影响 细胞经YE处理后，在其细胞提取物中检测到5种联苯类化合物，分别推断为2′-OH-aucuparin（1），3，5-dihydroxy-biphenyl（2），noraucuparin（3），aucuparin（4），eriobofuran（5）。随着诱导时间的延长，SASC合成的联苯类化合物总量呈上升趋势，但5种联苯类化合物在细胞中的含量则分别呈现出不同的积累规律见图1。

化合物1在YE诱导24 h后方可检测到，在48 h时该化合物的含量达到峰值，随着诱导时间的延长含量逐渐减少，但是在156 h时，其含量又呈现增加趋势。

化合物2在YE诱导24 h时浓度达到峰值，在其他检测时间点上该化合物的含量都较低。

化合物3是YE诱导后最先检测到的化合物，其含量表现出周期性波动的趋势，12～36 h其含量显著增加，36 h时出现峰值，36～96 h含量又显著下降，108～168 h含量再次缓慢增加。

化合物4含量相对其他化合物较高，在YE诱导24 h之后其含量逐渐增加，132 h含量达到最大值，132～168 h其含量呈现缓慢下降趋势。

YE处理后检测到化合物5的时间最迟，直到36 h该化合物才积累到一定的浓度。随着处理时间的延长，该化合物的含量呈波动性增加的趋势，168 h时其含量达到最大值。

由以上结果可知YE诱导子对SASC合成联苯类化合物的影响是一个动态的变化过程，随着处理时间的变化，SASC合成不同的联苯类化合物的组分及其组分间的配比都发生了改变。

3.2 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞生物量的影响 YE对SASC生物量的影响见图2中的实际值，为了解YE诱导后细胞生物量与CK组的变化，根据已得到的SASC生长曲线的拟合函数：f（x） =0.369 9/[1+10.77 exp（-0.329 2x）][5]。

将取样时间点代入函数，得到了细胞在正常生长条件下生物量的理论值（图2中的理论值），用得到的理论值减去实验中测得的实际值，得到了理论值和实际值之间的差值（图2中的差值）。

在添加YE诱导子后（如图实际值），细胞生物量呈现出缓慢的先增加又减少的过程，其变化幅度并不是很明显。在取样时间段内，细胞生物量变化不大。

分析理论值、实际值之间的差值，说明在YE的影响下，SASC增长曲线偏离了细胞增长模型的曲线，YE对SASC的影响整体表现为抑制作用。随着YE对SASC诱导时间的增加，YE对SASC的抑制作用也逐渐增大。

3.3 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞细胞悬浮液中pH的影响 随着处理时间的增加，细胞悬浮液的pH也越来越小。细胞悬浮液的pH变化大致为2个阶梯式下降，见图3。48 h至108 h，pH缓慢下降，在108 h时降至6.445，至此第1阶段结束；在120 h时细胞悬浮液pH降至6.045，在120 ～168 h，pH处于另一个下降阶段，但下降的幅度较上个阶段要大。

正常细胞培养状态下，细胞悬浮液中的pH随着培养时间的延长而逐渐升高[5]。添加YE后细胞悬浮液pH呈明显下降趋势，说明可能是SASC产生的次生代谢产物导致pH变化，并且这种pH的改变并不利于细胞的生长。

3.4 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞中可溶性蛋白质的影响 CK组细胞中的可溶性蛋白质含量表现为缓慢下降的变化趋势，见图4。在24，48 h时含量最高，随着时间的延长可溶性蛋白质的含量开始下降，在120，144，168 h 3个时间点上，可溶性蛋白质的含量相差无几。YE组SASC中可溶性蛋白质的含量呈现出缓慢下降，再趋于稳定的趋势。24～96 h细胞中的可溶性蛋白质含量逐渐下降，96 h之后细胞中的可溶性蛋白质含量逐渐趋于稳定。

将YE组细胞可溶性蛋白含量与CK组做差，得到YE处理后细胞中可溶性蛋白含量的增量，然后与CK组对比得到细胞内可溶性蛋白质的相对增量，见图5。从图中可清晰得出，YE处理后细胞内可溶性蛋白质含量与CK组对比，主要经历2个阶段，第1个阶段其相对增量大概在50%左右，120 h之后进入第2个阶段，细胞内可溶性蛋白相对增量达到了140%左右。

3.5 酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞外Ca2+流的影响 YE对细胞外Ca2+流的影响，YE组与CK组细胞外Ca2+都表现为内流现象，但是YE组Ca2+流平均值显著小于CK组。从动态流速图中也可以得出，虽然YE组与CK组都是在测定初期Ca2+内流速度较大，随着测定时间的延长速度逐渐减小，但YE组速度始终小于CK组。说明YE处理后导致细胞外Ca2+内流大量减少，见图6。

4 讨论

YE处理后SASC提取物中检测到5种联苯类化合物，而正常培养条件下细胞并没有合成这类化合物，说明细胞合成这类化合物来应对YE诱导子的胁迫。同时，随着处理时间的延长细胞培养液中的pH逐渐降低，细胞生物量与CK组比增长明显缓慢，说明SASC在YE胁迫下合成的次生代谢产物可能改变了培养液中的pH，导致了细胞的生长条件恶化、影响细胞膜的通透性，使细胞不能正常进行生长、分化、增殖等生命活动，最终导致细胞的生物量下降。

有研究推测联苯类化合物合成过程中有一定的转化顺序[9] ，本研究发现5种联苯类化合物含量随着处理时间的延长呈现不同的积累规律，整体表现为：1，2，3号化合物处理后12 h即可用现有方法检测到但相对含量较低，并且积累量迅速达到峰值然后下降，推断这3种化合物可能是联苯类化合物生物合成途径上的上游化合物或中间体；4，5化合物积累时间相对较晚，且呈较小波动的稳定积累状态，其可能处于合成途径的下游，结构相对稳定。本研究在一定程度上明确了联苯类化合物之间存在的转化，为明确转化顺序提供了依据。

YE组细胞中可溶性蛋白质的含量与CK组对比具有显著性差异，在YE诱导下，可溶性蛋白质的相对含量越来越大，最高时相对增量达到了147.76%，说明细胞为了抵抗真菌带来的伤害，对防治机制的投入也越来越多，多合成的可溶性蛋白质可能是初生生长所不需要的，用来调节催化次生代谢产物的合成。

本实验研究发现YE处理后SASC细胞外Ca2+内流与CK组对比显著减少，说明在细胞受到YE诱导子胁迫后，Ca2+作为信号分子可能介导细胞合成次生代谢产物的信号转导。

本实验通过分析生物量、细胞培养液中的pH以及细胞内可溶性蛋白含量的变化，发现YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制与道地药材形成的逆境效应的假说[10]基本一致。在不受外界环境胁迫的情况下，植物首先满足的是生长和繁殖；在面对不同因素的胁迫时，植物会合成次生代谢产物抵御外界不利环境，为此需要付出相应的成本，因而会降低植物的初生生长速度。此外，细胞应对YE胁迫迅速启动了Ca2+信号分子，说明Ca2+可能介导SASC合成次生代谢产物的信号转导。这些为YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制研究拓展了思路，为下一步深层次的研究打下了坚实基础。

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Mechanism exploration on synthesis of secondary metabolites in

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HUANG Lei， XIAO Wen-juan， YANG Guang， MO Ge， LIN Shu-fang， WU Zhi-gang， GUO Lan-ping

（State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

篇（3）

[关键词] 17-β雌二醇； 流体剪切力； 协同作用； 成骨细胞

[中图分类号] Q 25 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.016 正常状态下骨形成与骨吸收处于一种平衡状态，该平衡是由成骨细胞介导的新骨形成和破骨细胞介导的骨吸收作用来实现的。MC3T3-E1细胞株是成骨分化研究中的经典细胞株，很多学者将其用于骨形成机制的研究[1]。影响成骨及破骨细胞增殖及活性的因素有很多，雌激素和应力是影响成骨细胞活性及增殖的重要因素[2]。

研究[3-4]表明：雌激素对成骨细胞的功能有促进作用。还有学者[5]发现：流体剪切力（fluid shear stress，FSS）能够活化成骨细胞的跨膜受体，促进成骨细胞增

殖。Yeh等[6]通过研究证实：雌激素可以通过雌激素受体增加成骨细胞对FSS的敏感性。本实验采用MC3T3-E1成骨细胞系，对其施加不同浓度的17-β雌二醇及不同力值的FSS，探讨17-β雌二醇、FSS以及二者共同作用对成骨细胞增殖活性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

MC3T3-E1第3代细胞株（ADCC公司，美国）。17-β雌二醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT（Sigma公司，美国），胰蛋白酶（Gibco公司，美国），含105 U・L-1青霉素及100 mg・L-1链霉素的α-MEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（南京建成生物有限公司），Triton X-100（Fluka公司北京原生生物

技术有限公司分装）。Multiskan MK3酶联免疫检测仪（Thermo公司，美国），平行板流室加力装置（四川大学华西口腔医学院FSS课题组提供）。

1.2 细胞培养及传代

将第3代MC3T3-E1细胞系用α-MEM培养基（含体积分数为10%胎牛血清、105 U・L-1青霉素及100 mg・L-1链霉素）在37 ℃、5%CO2潮湿环境下培养，2～3 d换

液1次，待细胞均匀一层铺满培养瓶底部时，用0.25%胰蛋白酶消化获得细胞，用于后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1 17-β雌二醇处理分组 将用于17-β雌二醇处理的细胞等分为A、B、C、D、E共5组，每组再分为4个小组，分别标记为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4……以此类推。在A、B、C、D组的培养基中分别添加浓度为10-10、10-9、10-8、10-7 mol・L-1的17-β雌二醇，每一大组的4个小组分别培养1、3、5、7 d。E组为对照组，不加17-β雌二醇，其余处理同实验组。设置30个重复样本。

1.3.2 FSS处理分组 将用于FSS处理的细胞等分为a、b、c、d、e、f共6组，每组再分为3个小组，分别标记为a1、a2、a3、b1、b2、b3……以此类推。将各组细胞接种于放置在六孔板中的盖玻片上，移入细胞培养箱静置培养至细胞完全贴壁。采用平行板流室加力装置分批次对a、b、c、d、e组细胞分别施加每平方厘米力值为2×10-5、6×10-5、12×10-5、20×10-5、25×10-5 N的力，每组中3个小组的作用时间分别为15、60、120 min。f组为对照组，不施加FSS，其余处理同实验组。设置30个重复样本。

1.3.3 FSS+17-β雌二醇双因素处理分组 经上述实验筛选出17-β雌二醇的最佳浓度和最佳培养天数后，设置双因素作用组Ⅰ、FSS组Ⅱ、17-β雌二醇组Ⅲ、对照组Ⅳ。各组细胞的接种方法同1.3.2，其中Ⅰ、Ⅲ组添加最佳浓度的17-β雌二醇进行培养，Ⅱ、Ⅳ组添加等量DMSO培养，常规培养经1.3.1步骤筛选出的最佳天数后，Ⅰ、Ⅱ组施加经1.3.2步骤筛选出的最佳力值及时间。设置30个重复样本。

1.3.4 MTT检测 在规定时间内，将实验样本用0.25%胰蛋白酶消化获取悬浮细胞，将细胞分别置于EP管离心5 min，接种于96孔板中，添加适量培养基，静置培养6 h至细胞完全贴壁后，每孔加入5 g・L-1的MTT溶液20 μL，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，然后置于酶联免疫检测仪上检测，波长为490 nm，记录光密度A值。空白对照组做相同处理。

1.3.5 ALP活性检测 获取细胞及接种方法同上，根据ALP试剂盒的说明，分别加入试剂1、2液50 μL离心5 min后加入试剂3液50 μL，置于酶联免疫检测仪上检测，选择520 nm波长，记录吸光度A值。空白对照组做相同处理。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，同一时间组内比较采用单因素方差分析，不同时间组间两两比较使用秩和检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 17-β雌二醇处理组

不同浓度17-β雌二醇作用不同时间后，经MTT检测得到的A值见表1。从表1可见：同一处理时间，C组（10-8 mol・L-1组）多优于其他实验组，实验组多优于E组（对照组）；各处理时间组的表现趋势相同，均随着17-β雌二醇浓度的增高，成骨细胞活性增强，达到高峰后逐渐回落。各时间组的增长百分比结果见图1，可见各时间段的曲线趋势大致相同，随着17-β雌二醇浓度的升高，曲线升高，达到峰值后开始回落，其中5、7 d组中D组（10-7 mol・L-1组）呈现明显负增长，5 d组中C组（10-8 mol・L-1组）明显高于其他各组。

ALP结果的分析趋势与MTT相同，表现为C3组成骨细胞分化活性最佳。

2.2 FSS处理组

2.2.1 细胞形态观察 倒置相差显微镜下观察可见：FSS作用前细胞呈多角形、梭形，排列无序（图2左）；

FSS作用后细胞呈长梭形，细胞长轴沿力的方向排列（图2右）。

2.2.2 MTT检测结果 不同力值的FSS作用不同时间后，MTT检测结果见表2：每个作用时间组内，随着力值增大，A值呈上升趋势，到达高峰后，随着力值继续增大，A值则呈下降趋势；在3组数据中，作用60 min组明显高于其他组。经统计学检验，1组（作用15 min组）内各实验组与对照组的差异无统计学意

义（P>0.05）；2组（作用60 min组）内，c2组（12×10-5 N）优于其他各组，e2组（25×10-5 N）低于对照组（P

2.2.3 ALP检测结果 ALP检测结果见表3。经统计学分析，ALP的变化趋势与MTT结果基本相同，c2组（12×10-5 N作用60 min）成骨细胞的增殖活性最佳。

2.3 FSS+17-β雌二醇双因素处理组

将筛选出的最佳浓度（10-8 mol・L-1）17-β雌二醇和最佳FSS力值（12×10-5 N）用作双因素处理，不同处理组的MTT和ALP检测结果见表4。MTT数据分析结果显示：Ⅰ组大于其他3组（P0.05），但均大于对照组（P

3 讨论

随着我国国民结构的老龄化，骨质疏松患病率的增高、骨折危险性的增加及牙齿缺失后牙槽骨的吸收都成为现代医学亟需解决的问题。如何维持骨改建的平衡，促进骨的生长和重建，抑制或减缓骨吸收成为近年研究的热点。影响骨改建的因素很多，

雌激素和FSS刺激是其中2个重要的因素[2]，目前关

于这2种因素影响骨改建的研究也是一大热点。

雌激素是由卵巢分泌的一种性激素，能够维持机体的生理功能，可用来治疗由于雌激素缺乏所导致的各种疾病。这种替代疗法已得到普遍应用。雌二醇可以通过雌激素受体抑制成骨细胞凋亡，促进成骨细胞增殖，提高ALP活性，促使骨基质矿化。有研究[7]发现：成骨细胞是雌二醇的直接靶器官。本实验结果显示：成骨细胞的活性并不始终与17-β雌二醇的浓度呈正相关关系，在17-β雌二醇浓度为10-8 mol・L-1作用5 d时，细胞的增殖活性最佳，而随着浓度的继续升高，增殖活性开始降低。

机械应力是影响骨改建的另一个重要因素，适当的机械应力刺激能够促进骨组织的生长。在骨改建过程中，成骨细胞的增殖和分化有重要的作用。吴丹等[8]研究证实：FSS作用于成骨细胞后，其增殖能力提高，细胞活性增强。本研究结果表明：对体外培养的MC3T3-E1细胞施加FSS，力值为12×10-5 N作用60 min时，其促增殖效果最明显；加力后可见细胞长轴沿力的方向排列。FSS施加力值和时间长短不同，成骨细胞的反应也不同。随着力加载时间的延长，成骨细胞对应力的敏感性减弱，这可能与其逐步适应了应力刺激有关。当力值较大时，细胞活性反而降低，提示过大的应力非但不能促进成骨细胞的增殖反而会抑制其生长活性。在有关成骨细胞的体外研究中，应注意FSS强度的取值范围。

Genetos等[9]研究证实：骨小管内液体的流动对

成骨细胞的作用主要由剪应力介导。FSS加载装置有很多种，平行板流室加载系统有其独特的优势，在平行板流动小室里，能够达到层流和二维流动，通过调节蠕动泵来提供稳定有效的FSS，而且设备轻便，培养基更换方便，易于培养，易于镜下观察，加力所需培养基的量也较少。本实验所采用的四川大学获取专利的FSS加载装置能够精确地控制力值的大小[10]，较好地模拟了体内骨组织的成骨细胞受到的应力状态，其施加的FSS大小均一，并且可以调节到很小的范围，得到的实验结果具有代表性。

成骨细胞受到10-8 mol・L-1的17-β雌二醇和12×10-5 N的力影响时，细胞增殖活性明显高于单纯施加10-8 mol・L-1的17-β雌二醇和单纯施加12×10-5 N的加力组，提示17-β雌二醇和FSS对成骨细胞具有协同作用。这可能与二者提高了成骨细胞对彼此的敏感性有关，亦有可能与二者共同促进某一离子通道的开放或者激活某一信号通路有关。

综上所述，由本实验可以得出以下结论：浓度为10-8 mol・L-1的17-β雌二醇作用5 d时，成骨细胞的增殖活性优于其他17-β雌二醇处理组；FSS力值为12×10-5 N作用60 min时，成骨细胞的增殖活性大于其他FSS处理组；当二者同时作用于成骨细胞时，其增殖活性大于任一单因素处理组，此双因素具有协同作用。本实验为探讨体外培养成骨细胞的骨代谢相关信号传导通路提供了一定的参考。

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