葡萄A病毒RT-LAMP检测方法的建立

摘要：【目的】葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）是葡萄皱木复合病的重要病原之一,以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施,而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此,开展针对GVA的反转录环介导等温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）研究,旨在建立其RT-LAMP特异性检测方法。【方法】通过比对分析GVA的CP（coat protein）基因序列并经引物设计软件Primer Explore 4.0设计,获得6条检测引物GVA-FIP（5′-CTTACAGCCACGCTCAGAGTCC-CGTGGGAAGTTGGTTGTGT-3′）、GVA-BIP（5′-GCCCGTCAAAGGGGCTACAC-TCATA GGCGTTCTGTGCGA-3′）、GVA-F3（5′-AGAAGATGGGGATAGACCCG-3′）、GVA-B3（5′-CCGCCATTAACACGAGGAA-3′）、GVA-LF（5′-AT CCTTCCCACCAGCTCGG-3′）和GVA-LB（5′-TCAGGCAGATGTGTGAACCT-3′）。将RT-LAMP的反应温度分别设为59、61、63和65℃,根据1 h扩增曲线出现的先后次序确定最佳反应温度。以同样侵染葡萄的沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPa V）、葡萄卷叶病毒（Grapevine leafrollassociated virus,GLRa V）、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus,GFKV）的阳性材料及阴性对照（健康葡萄叶片,用NC表示）的总RNA为模板,对RT-LAMP方法的特异性进行测定。将GVA的总RNA进行10倍梯度稀释,得到10^1、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6倍的不同稀释液后用作模板分别进行RT-LAMP和普通RT-PCR检测,比较两者的灵敏度。RT-LAMP产物可进行实时扩增曲线检测,阳性样品在浊度仪上出现扩增曲线,阴性样品无扩增曲线;还可进行染料颜色反应检测,在反应产物中加入SYBR Green I染料,阳性样品产生肉眼可见的绿色,阴性反应为橙色。【结果】建立了GVA的RT-LAMP快速特异性检测方法,最佳反应温度为65℃。该方法约27 min即可检测到扩增曲线,而普通RT-PCR获得检测

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